生命中的过冷现象

关键字：过冷现象 　　在某些情况下，动物组织温度虽然在冰点以下，但不发生冻结，此即过冷现象(Supercooling)’但在致冷因素持续作用下降至某温度时过冷状态瓦解迅速发生冻结，该温度即组织的过冷点。水对生命极为重要，脱水、盐化、冻结均可对生命造成不利影响。在高寒地区冻结的影响较为普遍。在有些情况下，由于发生过冷现象抑制冰晶的形成，从而避免了冻结损伤。 　　1　单细胞的过冷与冻结损伤 　　人类很早就认识到，生物材料能在低温情况下长期保存而不致死亡。但是真正实现生物材料的深低温保存，始于本世纪五十年代。1949年英国剑桥大学的青年学者C*Polge将甘油作为低温保护剂，添加在精子的稀释液中，实现了精子的深低温保存，给生物材料的深低温保存的发展拉开帏幕［1］。此后，生物材料深低温保存技术开始迅速发展。譬如，血细胞的保存和成分输血、造血干细胞的保存和骨髓移植、精子的保存和人工授精、受精卵的保存和胚胎移植，以及角膜、皮肤、骨、细胞株、菌种等的深低温保存均得到广泛的应用。 　　生物材料虽然能深低温保存，但有时存活率偏低。要提高存活率将涉及许多问题，如冷却与解冻速率，合理的使用低温保护剂及其添加程序等。 　　实验表明，冷却速率十分重要。不同的生物材料有不同的最佳冷却速度，此速率附近存活率较高，否则存活率下降(图1)。为了解释这种现象，美国学者P*Mazur提出一个理论，认为导致细胞在冷冻过程中死亡的主要因素有两个，一个是细胞膜处于高浓度介质中的时间过长，这在慢速冷却时起主导作用；另一个是细胞内结冰，这在快速冷却时起主导作用。 　　在现今的低温生物箱中，细胞是置于某种液体介质中冷却。在冷却过程中存在着温度梯度，细胞内液的温度高于细胞外液体介质的温度。当温度降至某一程度时，胞外溶液中一部分水会结晶出来形成纯水的水晶，而剩余的未结冻的液体中溶质浓度将会越来越浓。此时细胞内、外原来的化学平衡被打破，胞内的水分子透过细胞膜向外渗透。在慢速冷却情况下，有足够的时间让水分子从胞内渗透到胞外。如冷却过慢，胞内水分渗出过多造成细胞皱缩，细胞内容质浓度也不断增高，最终细胞内液与胞外介质均变为高浓度溶液。由于电解质可使蛋白质变性，在高浓度溶液作用下细胞膜和细胞器发生损伤，称此种损伤为溶质性损伤。对于溶质性损伤，冷却速率越慢越严重，存活率越低，这是造成细胞死亡的第一个原因。 　　由于细胞膜对水的渗透率是有限值，在快速冷却时，胞内的水来不及渗出膜外，细胞外液已经结冰。此时，细胞内液处于过冷状态。过冷状态是一种亚稳定状态，可由于某种条件的变化，使过冷状瓦解，骤然结冰。而冷却速率越快，越容易使细胞内的过冷状态瓦解和发生结冰，这是造成细胞死亡的另一个原因。对于细胞内结冰造成的损伤，冷却速率越慢存活率越高。上述两个因素共同作用使存活率曲线近似抛物线形。 　通过上述分析，我们对问题有了定性的认识。若定量的研究这个问题就必须研究水分子透过细胞膜的动力学，建立细胞冻结过程水分子转移的动力学方程。美国学者P.Mazur对此做出贡献并推导出下述方程［2］： 　　式中V：胞内水体积；T：胞内温度；K：细胞膜对水的通透系数；A：细胞膜有效渗透面积；B：冷却速率；Vw：纯水摩尔体积；P0：细胞外液的水蒸气压；Pi：细胞内液的水蒸气压。 　　该方程是建立在物理化学模型基础上。这里一个重要的假设条件是在冷却过程中细胞内液处于冷状态而不结冰，细胞外介质是在水、冰、溶质共存情况下该方程才能成立。 　　一般情况，单细胞是在液氮中保存，其温度为—196℃。笔者实验发现［3］，红细胞、鱼受精卵等生物材料，在添加DMSO、甘油等低温保护剂后以不同降温程序降至—196℃时，绝大部分细胞内液发生冻结。虽有少数细胞内液未发生冻结，但在复温解冻时，其过冷的平衡条件遭到破坏，引起细胞内液的重结晶现象。综上所述，细胞深低温保存和解冻过程细胞内液结冰是不可避免的。笔者认为，添加低温保护剂的作用是增加细胞外介质的质点数，降低细胞外介质的冰点和过冷点，尽可能使细胞外介质和细胞内液同时结冰，以避免在冻结过程中过多地引起细胞内失水而发生的溶质性损伤。因此，对细胞冻结损伤的理论应该进一步探讨。 　　2　温血动物肢体的过冷现象及其耐寒特征 　　温血动物(包括哺乳动物和乌类)能够调节自己的体温，以抵抗环境温度的巨大变化。在高寒地区，譬如黑龙江省北部，冬季野外气温可达—50℃，而那里温血动物的体温(CoreTemperature)却相当恒定，一般维持在37℃附近，冬夏和日夜的变化不超过0.5℃。但是，这些动物肢体的组织温度却不是，它经常受环境温度的影响，有时很低，甚至在冰点以下处于过冷状态。

1983年在英国剑桥大学召开的第二十届国际低温生物学年会上张诚提出［4］，哺乳动物肢体组织的过冷现象是动物为适应寒冷环境而形成的抗寒能力，是进化的产物，是逐渐发展和完善的。这一概念为以后研究动物肢体的抗寒能力冻结损伤开辟了新的途径。笔者实验发现［5—7］，凡是能够长时间维持过冷亚稳定状态的肢体一般不出现冻结损伤。但是对于有些肢体，过冷状态一经瓦解随即发生冻结，不论冻结程度深浅复温后均出现不同程度的损伤。所以，组织中冰晶的形成是引起冻结损伤的关键环节。