盐酸氨溴索联合环丙沙星抗铜绿假单胞菌成熟生物膜作用研究
作者：李芳 余加林 杨华 李禄全 陈波曼。
【摘要】 目的 构建铜绿假单胞菌发光菌株，建立铜绿假单胞菌生物膜(biofilm，BF)模型，研究盐酸氨溴索对铜绿假单胞菌成熟BF的影响及与环丙沙星合用是否具有协同杀菌作用。方法 将携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的质粒转染铜绿假单胞菌，平板培养法培养铜绿假单胞菌BF，建立铜绿假单胞菌BF体外模型，经盐酸氨溴索作用后，扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)观察盐酸氨溴索对BF形态结构的影响，荧光显微镜定性观察盐酸氨溴索对BF内活菌的作用，通过发光菌株荧光强度定量分析盐酸氨溴索单独作用以及与环丙沙星联用后BF内活菌量。结果 盐酸氨溴索作用后电镜观察可见黏液样物变稀疏，不规则。盐酸氨溴索浓度大于0.49mg/mlBF内活菌数减少(F=18，P0.05)；盐酸氨溴索与环丙沙星存在协同作用(F=15.1，P0.05)，且随着盐酸氨溴索浓度升高协同作用增强。结论 盐酸氨溴索破坏铜绿假单胞菌成熟BF形态结构，减少其内活菌数；盐酸氨溴索与环丙沙星存在协同作用，增强其杀菌能力。
【关键词】 盐酸氨溴索； 环丙沙星； 铜绿假单胞菌； 生物膜。
ABSTRACT Objective To establish a biofilm model of Pseudomonas aeruginosa in vitro and observe the effect of ambroxol on biofilm of Pseudomonas aeruginosa, and study the synergistic effect with ciprofloxacin on tested specimens. Method Plasmids carried with green fluorescent protein (GFP) was tansfected to the strain of Pseudomonas aeruginosa. Plate culture method was used to establish biofilm model of Pseudomonas aeruginosa in vitro. After ambroxol was added to the biofilm, the appearance of the biofilm was detected by scanning electron microscope (SEM), and the viable counts of bacterial in biofilm after treated by ambroxol alone and together with ciprofloxacin were determined by bio—fluorescence method. Result After adding ambroxol, the biofilm was thin and abnormal compared with the control by SEM detection. Further detection with fluorescence microscope showed the viable bacteria in biofilm was reduced significantly (F=18, P0.05) when its concentration was higher than 0.49 mg/ml, destroyed furthermore, there was the synergistic effect between ambroxol and ciprofloxacin (F=15.1, P0.05). The effect enhanced with the increasing concentration of ambroxol. Conclusion Ambroxol destroyed furthermore the biofilm shape of Pseudomonas aeruginosa, restrained its growth, and had the synergistic effect on bactericidal activity with ciprofloxacin.
KEY WORDS Ambroxol; Ciprofloxacin; Pseudomonas aeruginosa; Biofilm。
生物膜(biofilm，BF)是细菌黏附在物体表面上形成的一种具有高度结构性的膜状复合物，其主要成分是细菌分泌的胞外基质和细菌菌体［1］。BF可使细菌具有抵御宿主免疫系统和抗菌药物杀伤作用，产生对抗菌药物的高度耐药性(可达到浮游状态的10～1000倍)，导致感染难以治愈［2］。铜绿假单胞菌是常见细菌生物膜相关感染病原菌之一，铜绿假单胞菌生物膜的形成是呼吸机相关性感染难以控制的重要原因。作者曾研究氨溴索可显著促进环丙沙星对细菌生物膜的透过［3］，本研究发现盐酸氨溴索对铜绿假单胞菌BF有抑制作用，且与环丙沙星联用后具有协同作用，增强杀菌活性，现报道如下。
1 材料和方法。
1.1 材料。
菌株PAO1(购自四川大学微生物实验室)，Luria—Bertani培养基(LB，上海升博生物技术公司)，盐酸氨溴索标准品(德国Boehringer Ingelheim)；环丙沙星标准品(重庆市药品检定所)，比浊仪(德国Siemens公司)，多功能酶标仪(美国BIORAD UV—3350型)，荧光显微镜(德国Leica公司)，SEM(美国Amary公司)，24及96孔培养板(美国Coring公司)。
1.2 方法。
(1)构建GFP标记的PAO1菌株 采取电转化对PAO1进行GFP)标记。首先制备感受态PAO1，然后进行菌株pGFPuv质粒转化和转化菌株筛选，提取转化菌株中质粒和转化菌株中质粒双酶切电泳鉴定，检测转化菌株中质粒稳定性。本实验获得较稳定遗传的GFP标记的PAO1菌株。
(2)环丙沙星最低抑菌浓度(MIC)的测定 采用微量稀释法测定环丙沙星对铜绿假单胞菌的MIC，质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。
(3)铜绿假单胞菌BF体外模型的建立 用平板法培养铜绿假单胞菌BF［4］。取隔夜培养的含有铜绿假单胞菌的LB培养液，调至1.5×108CFU/ml。分别吸取菌液1ml加入24孔板(其内放8mm×8mm玻片)，0.1ml加入96孔板。37℃培养，每48h换液一次，连续培养7d，即可形成稳定成熟的BF［5］。
(4)铜绿假单胞菌BF形态的SEM检测 本部分实验分为两组［对照组和盐酸氨溴索组(浓度3.75mg/ml)］。两组用平板法培养细菌7d，在24孔板内分别加入1ml LB培养基和盐酸氨溴索，37℃孵育24h后取出，用磷酸缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)反复清洗，去除浮游菌。立即用2．5%戊二醛PBS溶液中固定2h，再经0.1mol PBS冲洗2次(pH7.2)，30%～100%系列浓度乙醇脱水，经50%～100%叔丁醇置换，干燥、离子溅射仪喷金，经过SEM观察铜绿假单胞菌BF微观形态。
(5)荧光显微镜定性观察细菌BF内活菌数 本部分实验分为6组［空白对照组，不同浓度的盐酸氨溴索作用组(浓度依次为3.75、1.875、0.95、0.49和0.25mg/ml)］。在24孔板加入1ml菌液，平板法培养7d，分别加入1ml上述浓度的盐酸氨溴索和LB培养基，37℃孵育24h取出，用PBS反复清洗，去除浮游菌，取出玻片，置荧光显微镜下观察。
(6)多功能酶标仪定量分析盐酸氨溴索与环丙沙星合用后细菌BF内活菌数 细菌培养7d，棋盘法在96孔板内分别加入0.1ml不同浓度的盐酸氨溴索(浓度依次为3.75、1.875、0.95、0.49、0.25和0mg/ml)和环丙沙星(浓度依次为4、2、1、1/2、1/4和0MIC)，37℃孵育24h取出，用PBS反复清洗，去除浮游菌，用多功能酶标仪检测各孔荧光强度。
(7)统计学分析 所有数据输入SPSS11.5统计软件包，并行正态性分布检验，均符合正态性分布，后进行方差分析，显著性水平α=0.05。