聚乙二醇修饰海葵神经毒素rhk2a的分离与纯化

作者：黄慧,潘育方,郭晓娟,舒雅俊,杨帆。

【摘要】 目的 对聚乙二醇化海葵神经毒素(mPEGrhk2a)修饰产物进行分离与纯化。方法 将聚乙二醇(PEG)化反应所得混合产物超滤除盐后，采用SP650S强阳离子交换层析柱和CM650S弱阳离子交换层析柱进行分离纯化，收集不同NaCl离子浓度下的梯度洗脱液，经超滤除盐、冷冻干燥、SDSPAGE电泳检测，确定分离纯化mPEGrhk2a的色谱条件。结果 在保证mPEGrhk2a稳定性的前提下，随着缓冲液pH值的降低，2种阳离子交换柱与mPEGrhk2a的结合量均增加;在同一pH值下，强阳离子交换柱的结合情况更好。用SP650S强阳离子交换层析柱进行分离纯化时，洗脱液中溶液电导率在5～7 ms/cm时,mPEGrhk2a能被洗脱下来，而且盐离子浓度梯度变化越缓，mPEGrhk2a修饰产物各洗脱峰的分离度越高;用CM650S弱阳离子交换层析柱进行分离纯化时，修饰产物mPEGrhk2a主要在穿透峰中出现。结论 使用SP650S强阳离子交换层析柱，用pH 4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液与含0.5 mol/L NaCl 的pH 4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液(后者比例变化为0%→50%)进行梯度洗脱，修饰产物mPEGrhk2a与未修饰的rhk2a得到了很好的分离。

【关键词】 聚乙二醇化海葵神经毒素;阳离子交换层析;分离;纯化。

Abstract:Objective To isolate and purify mPEGrhk2a.Methods The mixture obtained from pegylated reactions was separated by Toyopearl SP650 column for strong ion exchange and Toyopearl CM650 column for weak cation exchange after desalted by ultrafiltration and the effluent of gradient elution was collected at various concentrations of sodium chloride,ultrafiltrated and freezedried,detected by SDSPAGE electrophoresis to determine chromatographic condition of isolate and purify mPEGrhk2a. Results With the preconditions of keeping mPEGrhk2a stable and reduced pH of buffer solutions,the binding capacity of both cation exchange columns and mPEGrhk2a increased. However,the capacity of the strong cation exchange was more than the week one. MPEGrhk2a was eluted by Toyopearl SP650 column for strong cation exchange when the concentration of NaCl was in the range of 5%～7%. The more slowly the concentration gradient changed,the higher of the resolution of diverse eluting peaks amongst modified products was. When using the Toyopearl CM650 column for weak cation exchange,the mPEGrhk2a mainly presented in penetration peaks. Conclusion The gradient elution was finished under the condition of 0.02 mol/L acetate buffer solution with pH 4.0 and the same acetate buffer solution (with the proportion change from 0% to 50%) containing 0.5 mol/L NaCl by using Toyopearl SP650 column for strong cation exchage. The products including pegylated and unmodified rhk2a were successfully isolated,which has laid a foundation for our further research on the properties of purified mPEGrhk2a.

Key words:mPEGrhk2a; cation exchange column chromatography; isolation and purification。

PEG修饰蛋白质技术由于能够在保证药用蛋白活性的同时降低其在体内的免疫原性和毒副作用，延长血浆半衰期，增强其化学稳定性，增大溶解性，提高药用蛋白在体内的生物利用度，增加患者的顺应性，已成功用于改善多种蛋白质药物的性质。2000年中山大学生命科学院利用基因工程技术获得一种重组海葵神经毒素rhk2a，其对心肌组织产生很强的正性肌力作用，在治疗充血性心力衰竭方面有极好的应用前景[1]。为解决海葵肽类毒素rhk2a临床应用时存在稳定性差、毒性较大等问题，本课题组将PEG修饰技术应用于rhk2a，通过对各种反应条件的优化，得到了最佳工艺条件下的甲基聚乙二醇(mPEG)修饰的海葵神经毒素产物mPEGrhk2a[2]。但在mPEG修饰rhk2a过程中，由于大部分mPEG与rhk2a的偶联反应都是随机性亲核反应，所以偶联修饰产物往往都是由多种不同的偶联蛋白异构体组成的混合物。本研究旨在对mPEGrhk2a修饰产物进行分离与纯化。

1 材料与仪器。

SP650S强阳离子交换层析柱料、CM650S弱阳离子交换层析柱料(日本TOSOH公司生产); Amicon TM Stirred Cell超滤装置、再生纤维素超滤膜(截留分子量1000)(美国Millipore公司);Biologic LP层析系统(美国BioRad公司);BETA18K型冷冻干燥机(德国CHRIST公司);Delta320pH计(梅特勒托利多公司)。

2 实验方法。

将rhk2a按照最佳工艺条件修饰后得到的mPEGrhk2a 修饰反应混合物， 用截流分子量为 1 000的超滤膜超滤除盐，然后用被缓冲溶液平衡后的阳离子层析柱进行分离纯化[3,4]，考察不同盐离子浓度缓冲液的分离效果，收集各洗脱峰的流出液，将收集液超滤除盐后， 转入50 mL离心管中， 于—80 ℃下预冻3～4 h，在—35～—20 ℃下抽真空冷冻干燥24 h，所得产物用TrisTricine系统进行SDSPAGE电泳检测。

2.1 平衡、洗脱缓冲液pH值的选择。

2.1.1 SP650S强阳离子交换层析柱平衡、洗脱缓冲液pH值的选择 取试管7支，各加 1 g SP650S强阳离子交换层析柱料后，分别用纯水洗涤，每次10 mL，洗5次。考虑到mPEGrhk2a的稳定性[5,6]，各加入pH值分别为4.0、4.6、5.0、5.4的醋酸钠醋酸缓冲液与pH值分别为6.0、6.5、7.0的磷酸钠磷酸缓冲液淋洗，每次10 mL，洗5次，待柱料平衡稳定，在每管中加入2 mg 的mPEGrhk2a，摇动试管5～15 min，静置待柱料下沉，取每管上清液于280 nm下测定其紫外吸收值。

2.1.2 CM650S弱阳离子交换层析柱平衡、洗脱缓冲液pH值的选择 取试管7支，各加 1 g CM650S弱阳离子交换层析柱料后，余下操作同“2.1.1”。

2.2 2种离子交换层析柱分离纯化修饰产物的条件。

SP650S强阳离子交换层析柱的规格为2.6 cm×4 cm(柱容量1 CV=25 mL)，柱平衡液为3 CV的pH4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液，流速为1 mL/min，检测波长为280 nm，色谱柱清洗液为5 CV 的0.5 mol/L NaOH溶液。CM650S弱阳离子交换层析法的色谱条件同上。

SP650S强阳离子交换层析法用于梯度洗脱的缓冲液见表1;CM650S弱阳离子交换层析法依次更换的洗脱液为NaCl含量分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 mol/L 的pH 4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液各5 CV。

3 结 果。

3.1 SP650S强阳离子交换层析和CM650S弱阳离子交换层析洗脱条件的选择与比较表1 SP650S强阳离子交换层析法所用的梯度洗脱液醋酸盐缓冲液的比例第一组100%→0%0%→100%(20 CV)第二组前半段100%→40%0%→60%(20 CV)后半段40%→0%60%→100%(10 CV)第三组100%→50%0%→50%(20 CV)。

用一系列不同pH值的缓冲液平衡2种离子交换层析柱料，测得其相应上清液的紫外吸收值，结果如表2所示，随着缓冲溶液pH值的升高，上清液的紫外(UV)吸收值增加，即洗脱液中的蛋白质含量增加;缓冲液的pH值越低，离子交换柱料与mPEGrhk2a的结合量越大,在同一pH值下，SP650S强阳离子交换柱料的mPEGrhk2a结合情况优于 CM650S弱阳离子交换柱料。因此，选用pH4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液平衡、洗脱2种层析柱，此时色谱柱有效交换容量最大，mPEGrhk2a的分离效果相对较好。表2 不同pH值缓冲液下SP650S与CM650S柱料上清液的紫外吸收值。