貂心与其伪品的脱氧核糖核酸指纹特征研究
作者：杨明妍 刘洋， 张丽华， 李明成， 王冰梅。
【摘要】 目的探讨貂心脱氧核糖核酸(DNA)指纹特征鉴定方法。方法采用碱裂解法提取新鲜貂心与伪品动物组织中线粒体DNA，设计特异性引物，进行PCR扩增。结果从新鲜貂心及鸡心、鸭心、鹅心、兔心等伪品动物组织中提取出相同大小的16.8 Kb线粒体DNA，只有貂心DNA可扩增出1 100 bp大小的片段。结论貂心DNA具有特异性指纹特征，所得貂心DNA指纹特征图谱可用于与其伪品动物心脏的鉴定及分析，且方法简便，结果可靠。
貂心是名贵的药材, 是利心丸[1]中的主要成分。貂心在药品检验中尚无完善的检验方法，现有的检验方法只有企业内控标准的性状鉴别，无法对貂心的真伪作出准确的判断。
DNA指纹图谱技术为中药材及其伪品的鉴别提供了一条新的途径[2,3]， 本文应用分子生物学技术，对貂心及其伪品进行了DNA指纹特征研究，采用碱裂解法提取新鲜貂心与伪品动物组织中线粒体DNA，设计特异性引物，进行PCR扩增。建立了貂心DNA指纹鉴定方法，确立了貂心DNA指纹特征图谱，为貂心与其伪品的鉴定提供了一种分子生物学检测手段。
1 材料与仪器。
1.1 药材新鲜貂心、鸡心、鸭心、鹅心、兔心均由农业部长白山野生生物资源重点野外科学观测实验站提供。
1.2 试剂Buffer A：0.25 mol/L,0.03 mol/L Tris—HCl,1 mmol/L Na2EDTA，(pH 8.0);Buffer B：0.25 mol/L 蔗糖，0.05 mol/L Tris·HCl，7 mmol/L MgCl2, pH 8.0;Buffer C ：(0.05 mol/L Triso HCl，0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Na2EDTA，pH 8.5;Dnase I反应终止液：0.25 mol/L 蔗糖, 0.1 mol/L Na2EDTA,pH 8.0;购自北京鼎国生物技术有限责任公司。Taq DNA聚合酶：大连宝生物工程公司;琼脂糖：购置England。
1.3 仪器紫外透射仪(ZF型)：中国上海;电泳仪、电泳槽(DYY—Ⅲ2)：北京六一仪器厂;Gene Amp R PCR System2700 Applied Biosystem：美国Perkin—Elmer公司;UV WHITE2020D凝胶成像分析系统：美国Cold spring 公司。
2 方法。
2.1 线粒体DNA 的提取[4,5]①取新鲜的组织，用Buffer A洗净，剪碎，研磨，按1∶5的重量体积比稀释，4 000 r·min—1 4℃离心30 min，吸上清，除去核及细胞膜碎片。②上清液12 000 r·min—14℃离心30 min,弃上清，沉淀为线粒体。③用Buffer B洗涤1次，按0.5 ml·g—1组织的比例悬浮，加Dnase I使终浓度达100 μg·ml—1，30℃保温45 min,冰浴冷却，加入2倍体积的Dnase I反应终止液，12 000 r·min—1 4℃离心30 min,沉淀用Dnase I反应终止液洗涤一次，重复离心，得纯净的线粒体。线粒体用Buffer C悬浮(0.5 ml·g—1)，加入10%SDS至终浓度0.8%，37℃保温15min，冰浴冷却，加等体积的饱和酚轻微震荡至溶液呈乳白色，冰浴30 min。12 000 r·min—1 4℃离心10 min，取水相重复提取至界面无蛋白为止。④上层水相再用氯仿/异戊醇(24∶1)提取3次去酚，水相中加入0.2倍的1 mol/L NaAc,混匀，再加入2倍体积的预冷—20℃的无水乙醇，混匀置于低温冰箱中过夜。12 000 r·min—1 4℃离心30 min,真空干燥，溶解于TE缓冲液。⑤加入Rnase至终浓度为50 μg·ml—1，37℃保温1 h，然后用饱和酚、氯仿/异戊醇各抽提3次，水相中加入1 mol/L NaAc及无水乙醇沉淀mtDNA，用70%乙醇洗涤3次，干燥，以TE溶解，即得纯品。—20℃保存。
2.2 紫外分光光度法的测定mt DNA将所获得的mt DNA样品经适当稀释，用紫外分光光度仪测定光吸收值A260、A280值，计算A260/A280比值。
2.3 琼脂糖凝胶电泳制备0.7%琼脂糖凝胶(含EB 0.5 mg/L)，取5μl mt DNA样品并加入1 μl上样缓冲液混匀后点样, 60 V，90 min，成像并拍照。
2.4 PCR检测应用Primer5.0引物设计软件设计貂心的特异性引物(由上海生物工程公司合成)。PCR反应体系：总体积为30 μl，循环条件，94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环后于72℃延伸10 min。用2%琼脂糖凝胶电泳， 80 V，40 min，成像，拍照。