蟾毒灵的大鼠在体肠吸收机制研究
作者：刘颖 冯年平 许洁 巫珊 张欣。
【摘要】 目的研究蟾毒灵的大鼠在体肠吸收机制。方法采用大鼠在体肠单向灌流吸收实验模型，并应用重量法校正灌流液体积，考察吸收部位、药物浓度、pH值及P—糖蛋白(P—gp)抑制剂对药物吸收的影响。结果蟾毒灵的吸收速率常数（Ka）和表观吸收系数（Papp）分别按照空肠、回肠、十二指肠、结肠的顺序下降。2～20 μg · ml—1的药物浓度对Ka和Papp无显著影响（P＞0.05）；灌流液pH值对药物吸收有影响；含P—gp抑制剂组与不含P—gp抑制剂组相比，Ka和Papp无显著性差异（P＞0.05）。结论蟾毒灵为全肠段吸收，吸收机制为被动扩散，且P—gp对药物的小肠吸收基本无影响。
Abstract：ObjectiveTo evaluate bufalin in situ intestinal absorption mechanism. MethodsThe rat single—pass intestinal perfusion technique was applied, and the gravimetry was used to correct the perfusion volume. The concentration of bufalin was determined by HPLC. The effects of absorption site, drug concentration, pH value and P—glycoprotein (P—gp) inhibitor on bufalin absorption were studied. ResultsThe order of the drug absorption constant(Ka) and apparent absorption coefficient(Papp) was as follows：jejunum＞ileum＞duodenum＞colon. Drug concentration had little effect on Ka and Papp (P＞0.05).pH value of the drug solution affected drug absorption. There was no significance in Ka and Papp between presence of P—gp inhibitor and no P—gp inhibitor（P＞0.05）. ConclusionBufalin can be absorbed at all intestinal segments. The absorption of bufalin is a passive diffusion process and not affected by P—gp.
Key words：Bufalin; Intestinal absorption; Single—pass intestinal perfusion 蟾毒灵是名贵中药蟾酥Venenum Bufonis中的一种有效成分。蟾毒灵具有较强的抗肿瘤作用，作用机制涉及诱导细胞凋亡、分化、抑制肿瘤的血管生成等［1～3］。近些年，有学者对蟾毒灵脂质体、透皮给药制剂等方面进行研究报道［4，5］，但有关其在体肠吸收的研究未见报道。研究药物体内吸收部位和机制是药物制剂处方前研究的重要内容，为剂型的设计提供生物药剂学依据。本实验采用大鼠在体肠段原位单向灌流法考察蟾毒灵的吸收部位及探讨吸收机制，为蟾毒灵的制剂研究提供理论依据。
1 器材。
1.1 试药蟾毒灵原料（江西本草天工科技有限公司）；蟾毒灵对照品（sigma公司）；盐酸维拉帕米标准品（中国生物制品检定所）。空白灌流液（Krebs—Ringer‘s营养液，自配，每1 000 ml含NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖 1.4 g）；甲醇（色谱纯，上海安谱科学仪器有限公司）；其余试剂均为分析纯。
1.2 仪器 HL—2B数显恒流泵（上海沪西分析仪器厂）；红外灯（上海安大照明电器有限公司）；Angilent1200series高效液相色谱仪； Agilent G1314A紫外检测器；Agilent 8453紫外—可见分光光度计；BP210S电子天平（德国Sartorius）；PHS—3S型pH计（上海精密科学仪器有限公司）；DKB—501A型超级恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）。
1.3 动物 SD大鼠，清洁级，雄性（200±20）g，上海中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(沪)2003—0002。
2 方法与结果。
2.1 HPLC分析方法的建立。
2.1.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm, column No：99903）；流动相为甲醇∶水（70∶30）；流速 1.0 ml · min—1；柱温30℃；检测波长 300 nm；进样量20 μl。
2.1.2 方法学验证 用Krebs—Ringer‘s营养液分别配制蟾毒灵溶液、维拉帕米溶液。分别取上述两种溶液及空白Krebs—Ringer‘s营养液进样，在“2.1.1”项下色谱条件下测定，色谱图如图1～3所示。空白Krebs—Ringer‘s营养液及维拉帕米在此条件下对蟾毒灵的测定均无干扰。精密称取蟾毒灵对照品适量,用空白Krebs—Ringer‘s营养液配制0.2，1.0，2.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μg · ml—1的蟾毒灵溶液，进样，测定。以蟾毒灵峰面积（A）对浓度（C）作线性回归，得蟾毒灵的标准曲线方程为：A=13.107C—0.476 6，r=0.999 5(n=3)。线性范围0.2～20 μg · ml—1。高、中、低3种浓度的回收率为98.2%～101.1%（n=5）,日内、日间精密度RSD均小于2%（n=5）。
图1 空白Krebs—Ringer‘s营养液HPLC图（略）。
2.2 蟾毒灵在肠灌流液中的稳定性考察 用空白Krebs—Ringer‘s营养液分别配制高（20 μg · ml—1）、中(10 μg · ml—1) 、低(2 μg · ml—1）浓度的蟾毒灵溶液作为供试液，置于37℃恒温水浴中，分别于0，30，60，90，120 min取样，按“2.1.1”项下色谱条件测定，并计算浓度。在120 min内蟾毒灵于肠灌流液中的含量无明显变化，RSD＜1%，表明其基本稳定。