梯度密度离心法分离肝癌细胞及其转移性细胞株的建立
作者：张萌， 胡少为， 姜桔红， 文剑明。
【摘要】 【目的】 建立新的肝细胞癌细胞系，为肝癌实验研究提供更多纯化癌细胞。【方法】 从肝细胞癌患者原发灶和门脉癌栓中获取癌组织，采用Percoll浓度梯度分离癌细胞进行培养，用微环境消化法获取癌细胞克隆并建立细胞系，对培养成功的细胞系进行生长曲线测定、染色体G带核型分析、对比基因组杂交和裸鼠接种成瘤实验。【结果】 对20例肝癌组织进行癌细胞分离培养和克隆，成功建立2例细胞系H2M和H4M，这2株细胞均来自门脉癌栓，它们的染色体数目测定均为超3倍体（71～78条）。CGH检测显示H2M主要的细胞遗传学改变为染色体4q、13q、16q、17p和19p缺失和1q、3q、5p、6p、7q和8q扩增，其中有一条标记染色体含有1q和6p［t(1;6)染色体］；而H4M染色体8p, 9, 13q, 16q 缺失和6p, 7p, 11p, 11q13扩增，其中有一条标记染色体含有一长的均染区（hsr）。H2M细胞接种裸鼠1个月，产生典型的人肝细胞癌，但H4M接种尚未能成瘤。【结论】Percoll浓度梯度分离癌细胞和微环境消化法取得癌细胞克隆是建立原代细胞系的有效方法。2例肝癌细胞系的建立为以后肝癌研究提供了实验材料，所测出的肝癌细胞系的细胞遗传学改变及在裸鼠接种成瘤，为肝癌细胞癌基因和抑癌基因筛选提供了研究线索和实验模型。
Abstract:【Objective】To establish hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines and provide more pure liver carcinoma cells for HCC studies.【Methods】The carcinoma tissues were obtained from the primary lesion and metastatic lesion in portal vein of HCC. The carcinoma cells were isolated by Percoll density gradient centrifuge and cultivated. The cell clones were then obtained by micro—environmental digestion and cell lines were established. The growth curves, G band chromosome karyotype, comparative genomic hybridization (CGH) of the established cells were characterized. The cells were implanted in nude mice for tumorigenesis.【Results】 20 cases of HCC cells were isolated and cultivated. Two cell lines (designated as H2M and H4M) were successfully established from 2 cases of emboli of portal vein. The karyotype showed that both cell lines are a hypertriploid (71～ 78 chromosomes). A marker chromosome containing 1q and 6p ［t(1;6)］ was found in H2M cells and a huge marker chromosome containing a long homogeneously staining region (hsr) in H4M cells. The main genetic alterations analyzed by CGH were a high copy number amplification of 1q, 3q, 5p, 6p, 7q and 8q and loss of 4q, 13q, 16q, 17p 19p in H2M cells, whereas, amplification of 6p, 7p, 11p, 11q13 and loss of 8p, 9, 13q, 16q in H4M cells. Implantation of H2M cells in nude mice for a month produces typical human hepatocellular carcinoma, but no tumor for H4M cells.【Conclusions】 Percoll density gradient centrifuge and micro—environmental digestion is an effective method for cloning of primary carcinoma cell and cell line establishment. Two established HCC cell lines will provide culture cells for HCC studies. The genetic alterations detected in both cell lines also provide clues and cell models for further screening of oncogenes and tumor suppressor genes in HCC.
Key words：hepatocellular carcinoma; HCC cell lines; karyotype; comparative genomic hybridization。
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是常见癌症之一。尽管已有多个肝癌细胞系供实验室研究用，但这些细胞多由国外研究人员建立，而且极少从门脉转移灶建立[1]。此外，已建立的细胞系缺乏细胞遗传学改变的资料，不能为肝癌癌基因、抑癌基因的筛选及肝癌转移机制研究提供线索。本文描述2例门脉转移性肝癌细胞系的建立过程并检测其分子遗传学改变，旨在为HCC的深入研究提供实验工具。
1 材料和方法。
1.1 标本来源。
20例肝癌组织取自中山大学附属第一医院肝胆外科手术标本，每份癌组织均取原发灶和门脉癌栓，经病理检查证实和进行细胞培养。
原发瘤及门脉癌栓组织用含5倍浓双抗（500 u/mL青霉素和500 ?滋g/mL链霉素）PBS冲洗后剪成约1 mm3大小，用0.1%的胶原酶（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）在 37 ℃下消化30 min，用120目不锈钢网过滤。将细胞悬液铺入装有等渗梯度密度PercollTM（Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）的50 mL塑料离心管的上层，Percoll浓度梯度从底层至最高层依次为70%、50%、40%，每层5 mL。4 ℃下3 500 × g离心30 min，离心后在40%层内吸取含细胞的Percoll液，用F12培养液稀释5倍，275 × g离心10 min。沉淀细胞洗涤3次。最后用含20%胎牛血清、10 ng/mL表皮生长因子（EGF）、10 ?滋g/L转铁蛋白、10mmol/L谷氨酰胺、100 mg/L丙酮酸钠、100 U/mL青霉素和100 ?滋g/mL链霉素的 F12培养液悬浮。将5 mL含1×106细胞的培养液接种在25 cm2塑料培养瓶（Corning, USA），置37 ℃、饱和湿度的5% CO2孵箱培养。
培养数天后，通过微环境消化法获取癌细胞克隆。具体方法如下：先将细胞稀释传代，待细胞生长2~3 d，然后在倒置显微镜下对单个分散存在的癌细胞克隆位置在平皿底部用油性笔定位标记。将培养液吸去，加入2 mL的0.25%胰酶与0.02íTA的消化液预消化。用一弯头管口平整的玻璃吸管吸取约10 ?滋L的消化液，让消化液保持在吸管口处，将吸管口置于所标记的细胞克隆上面，吹出微量的培养液，随即将培养液重新吸回吸管。将含细胞的消化液置入24孔培养板内，加入约1 mL的培养液继续培养。待细胞增多时再进行扩大培养。
采用这种方法，成功培养2例男性肝癌患者的肝癌细胞系，2例均取自门脉癌栓，分别命名为H2M和 H4M。
1.4 生长曲线。
将培养第12代的H4M细胞5.4×104接种在直径5 cm的塑料平皿，于接种后第2天开始将细胞消化计数，每天消化3个平皿的细胞数并计算平均值，连续7 d，最后绘制细胞生长曲线和倍增时间。H2M 采用第16代细胞，接种密度为7×104每平皿，计算方法同上。
1.5 细胞核型分析。
于培养的H2M和H4M细胞中加入0.3 ?滋g/ml的秋水仙素，继续培养3h，胰酶消化收获细胞，经0.07 mmol/L氯化钾低渗处理30 min，于1:3冰醋酸甲醇液固定2 h后滴片，所获的中期分裂相染色体用标准胰酶—基姆萨（G带）分带染色法染色。