应用激光解吸电离飞行时间质谱技术筛选无精子症患者精浆差异蛋白
作者：刘池波，梁勇，潘春琴，张瑾。
【摘要】 目的:用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI—TOF—MS）分析无精子症和正常人精浆蛋白指纹图谱的变化，建立能鉴别无精子症和正常人精浆标志物的诊断模型。方法:收集33例无精子症和31例正常人的精浆，用H50（疏水芯片）蛋白质芯片和SELDI—TOF—MS检测蛋白质质谱的表达。用Biomarker Patterns Software分析软件进行数据处理，建立区分无精子症和正常人精浆中蛋白质谱差异表达模型。结果:在分子量2 000～20 000范围内，共检测到78个有差异的蛋白峰，其中12个差异有显著性（P 0.01），建立了由3个差异蛋白组成的无精子症诊断模型，其诊断灵敏度为96.9%（32/33），特异性为96.7%（30/31）。结论:用SELDI—TOF—MS技术初步建立的区分无精子症和正常人的精浆蛋白差异表达模型可以区别无精子症和正常人，可能为无精子症的诊断提供新的手段。
Abstract: Objective: To analyze the spectrometric semen protein profiling of azoospermatism and healthy controls by surface—enhanced laser desorption/ionization time—of—flight mass spectrometry （SELDI—TOF—MS）， to establish semen marker pattern for the diagnosis of azoospermatism. Method: The semen samples in 33 cases of azoospermatism and in 31 cases of healthy controls on H50 proteinchip were collected，the spectrometric protein profiling was detected by SELDI—TOF—MS， the data were analyzed by Biomarker Patterns Software provided by Ciphergen Corp. A primary diagnosis model of azoospermatism was set up. Result: Seventy—eight protein peaks were detected at the molecular range of 2 000～20 000 Da， among which 12 ones were significantly different between azoospermatism and controls（P 0.01）. A diagnostic pattern consisting of 3 protein peaks was established with sensitivity of 96.9% （32/33）， specificity 96.7% （30/31）. Conclusion: It is successful to develop and evaluate the different spectrometric protein profiling patterns of azoospermatism and healthy control by SELDI—TOF—MS. This affords possibly a new method to diagnosis of azoospermatism.
Key words: microchip analytical procedures；azoospermatism；protein。
无精子症是男性不育领域中最常见的疾病之一，其病因及发生机制尚未完全明确，因此有待加强病因学和特异性诊断标志物的研究。本研究采用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术(surface—enhancedlaser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI—TOF—MS)结合H50蛋白质芯片对无精子症患者精浆进行研究，探索其精浆中的蛋白质指纹图谱，希望发现一些特异性的蛋白质，从而对无精子症的病因、诊治有所帮助。
1 材料和方法。
1.1 材料。
1.1.1 样本：所有无精子症精浆标本取自2007年6月至12月间来本院男性科就诊的人群，共33例。无精子症患者精液标本经3 000 r/min离心15 min，沉淀镜检无精子。正常对照组31例来源于健康体检者，精液常规及特殊生化检查均正常。无精子症组平均年龄（29.7±4.8）岁，正常对照组平均年龄（30.2±4.4）岁，两组间年龄匹配。所有的精液标本均在禁欲3～5 d取出，离心分离精浆1 ml后储存于—80 ℃低温冰箱中。
1.1.2 试剂及芯片: 乙腈、三氟乙酸、尿素、蛋白酶抑制剂、Hepes、Tri—HCl、CHAPS和OGP均购自Sigma公司。H50蛋白质芯片和阴离子交换柱（Hyper Q DF）购于美国BIO—RAD公司。
1.1.3 蛋白质芯片阅读机: 蛋白质芯片阅读机（美国Ciphergen公司生产PBSII—C型）是基于激光解吸离子飞行时间质谱的原理，检测范围从1 kD小分子物质和多肽到500 kD 以下的大分子。
1.1.4 蛋白质芯片: H50蛋白芯片专门用于结合蛋白或多肽通过反向或疏水性相互作用。其类似于C6—C12烷基层析吸附剂。当使用H50表面时，蛋白利用其疏水性保留在芯片表面。H50的选择性通过binding/washing溶液中的有机溶剂的数量和（或）盐浓度来决定。
1.2 方法。
1.2.1 样本处理: 取10μl精浆样品，加20μl 8 mol/L尿素，于4 ℃以400～600 r/min振摇30 min，吸取上清用于蛋白质芯片检测。
1.2.2 芯片处理: 用10μl 10 mmol/L HCl预处理H50蛋白芯片上A—H点10 min，用M—Q水洗芯片3次，将芯片安装于bioprocessor上，芯片A—H点滴加200μl结合缓冲液（10% ACN），室温下振荡孵育5 min，弃掉液体，每点分别加10μl精浆/尿素混合物和90μl结合缓冲液，振荡孵育30 min，弃掉液体，用200μl洗脱缓冲液洗涤芯片2次，每次5 min，卸去bioprocessor，芯片用M—Q水洗涤1次，待芯片表面自然晾干后，各点加两次0.5μl SPA，芯片表面干后，用蛋白质芯片阅读机（PBSII—C型）进行蛋白质谱分析。
1.2.3 数据采集: 蛋白质芯片采用蛋白质芯片阅读机PBSII—C型读取数据。 仪器每天用标准多肽和低于200 kD的蛋白质标准分子校正，系统的质量偏差为0.1%。检测芯片时蛋白质芯片阅读机设置如下:激光强度为195，检测敏感度为9，优化分子质量范围为2～20 kD，最高分子量达150 kD，每个样品收集64个点，采用Ciphergen proteinchip 3.0.2版本的分析软件自动采集数据，采用Biomarker Wiz—ard和Biomarker Pattern软件分析无精子症患者和正常人精浆的蛋白质谱差异并建立分类树模型。
1.3 统计学处理方法 采用Ciphergen protein— chip3.0软件对数据进行统计学处理。
2 结果。
2.1 无精子症患者与正常人精浆蛋白质谱相比有12个差异蛋白 将正常人和无精子症患者精浆样品加样于H50蛋白质芯片上，采用SELDI—TOF（PBSII—C型蛋白质芯片阅读机）分析，自动收集蛋白质峰，设有意义峰的最低信噪比为5，最低出现频率阈值为30%，再用Biomarker Wizard软件对所有测得蛋白质谱统一进行标准化后，对患者和正常人精浆中蛋白质峰的数量和相对强度进行比较和统计分析，结果显示，每个谱图平均有78个蛋白质峰，与正常人精浆蛋白质谱相比，无精子症患者精浆中有5个标志分子稳定上调，7个标志分子稳定下调（见表1）。
2.2 分类树模型的建立及检测结果 采用Ciphergen公司Biomarker Pattern软件对来源于Biomarker Wizard的数据进行处理，结果显示，没有一个单独的标志蛋白能将无精子症患者和正常人完全分开。进一步分析显示9 939.6 Da和4 974.6 Da两个标志蛋白被Biomarker Pattern分析系统自动选取用以建立分类树模型，此分类树具有两层3个叶结点(见图2)。64例样本在根结点处(node 1)被9 939.6Da标志蛋白划分成两组，峰值3.026的34例样本被划分到左侧的枝结点node 2内，诊断为无精子症患者；峰值3.026的30例样本划分到右侧的叶结点terminal node 3，诊断为正常人。node 2的34个样本继续被4 974.6 Da标志蛋白划分，最终在叶结点1（terminal node 1）中有33例样本，其中32例为无精子症，1例为正常对照；叶结点2(terminal node 2)内1例为正常对照；叶结点3内有无精子症患者1例，正常对照为29例。采用9 939.6 Da和4 974.6 Da标志蛋白组合样式建立的无精子症诊断模型，其划分上述样本的结果见表2。
此分类树的根结点为9 939.6 Da，如样本在9 939.6 Da的峰值强度为3.026，则被分到左侧的枝结点2处，反之划分到右侧的叶结点3处；4 974.6 Da标志蛋白的划分值为2.952，最终此分类树形成3个叶结点，将64例样本分开。