体外冲击波促进兔ACL重建后腱骨愈合的实验研究
作者：石斌 刘玉杰 李志超 邬晓勇,朱娟丽 眭翔 张锦佳 陈琳。
【摘要】 ［目的］观察采用体外冲击波（extracorporeal shock waves，ESW）治疗对ACL重建后腱骨愈合的影响。［方法］采用趾长伸肌肌腱建立兔ACL重建动物模型， 2～3个月龄雌雄不限健康新西兰大白兔18只随机分为2组，ESW组ACL重建术后24 h给予冲击波治疗，对照组ACL重建术后不给予冲击波处理，术后2、4、8周处死动物取标本做HE和Masson三色染色观察组织愈合病理学改变，血管墨汁灌注观察愈合组织新生血管含量。［结果］ESW组术后4周腱骨界面成纤维细胞和成软骨细胞增生活跃，胶原纤维合成明显增多、排列规则。术后8周腱骨界面由致密结缔组织连接，胶原纤维大量合成，呈垂直纵向规则排列，部分区域出现胶原纤维—纤维软骨组织—骨组织的移行带改变，形成类似韧带直接止点样结构。腱骨界面组织愈合较对照组迅速。术后4周和8周腱骨界面新生血管的含量ESW组显著高于对照组（P＝0.028，P=0.008）。［结论］体外冲击波治疗可显著促进兔ACL重建后早期腱骨愈合。
【关键词】 体外冲击波（ESW）； 腱骨界面； 腱骨愈合； 血管墨汁灌注。
Abstract：［Objective］To explore the effects of extracorporeal shock waves(ESW) therapy on tendon—bone healing after reconstruction of the anterior cruciate ligament(ACL).［Method］Animal model of reconstruction of the anterior cruciate ligament in 18 healthy F/M New Zealand white rabbits (2～3 months old) were established using digital long extensor tendon and randomly classified into 2 groups. The ESW group was given extracorporeal shock waves therapy on 24 hours after reconstruction of the anterior cruciate ligament while the control group with only reconstruction of the anterior cruciate ligament but no more therapy. All animals were sacrificed at 2、4、8 weeks after operation for histological examinations. The specimens were stained with hematoxylin—eosin and Masson trichrome to investigate pathology change of the tendon—bone healing tissue. The ink intravascular injection was used to observe the neo—vascularization of tendon—bone healing tissue. ［Result］The histological examination revealed that at 4 weeks after operation, the ESW group, tendon—bone interface was filled with proliferated fibroblasts and chondroblasts, the collagen fibers were obviously increased and regularly arranged. At 8 weeks after operation, the healing tissue at the bone—tendon interface had developed into dense connective tissue, the collagen fibers were formed in abundance and the perpendicular collagen fibers were regularly and longitudinally arranged. The transition zones of collagen fibers, fibrocartilage and bone(the structure alike a direct ligamentous insertion) occurred in the local region of tendon—bone interface. The histological observations showed that the tissue healing at tendon—bone interface of the ESW group were quicker than those of the control group. The proportion of neo—vessels at the tendon—bone interface of the ESW group were significantly higher than those of the control group at 4 and 8 weeks after operation(respectively P＝0.028，P=0.008). ［Conclusion］Extracorporeal shock wave treatment can significantly improve the tendon—bone early healing after reconstruction of the anterior cruciate ligament in rabbits.
Key words：extracorporeal shock waves(ESW)； tendon—bone interface； tendon—bone healing； ink intravascular injection。
交叉韧带是膝关节重要的静力和动力性稳定结构，一旦损伤难以自愈，常造成严重的膝关节不稳，继发半月板损伤和骨关节炎。为了恢复膝关节的正常结构和功能，常常需要手术重建交叉韧带，而术后成功的关键在于肌腱移植物与骨隧道的牢固愈合。本实验观察采用体外冲击波（ESW）干扰治疗对兔ACL重建术后腱骨愈合的影响。
1 材料与方法。
1.1 实验动物及分组。
2～3个月龄健康新西兰大白兔18只，雌雄不限，体重平均为2.5 kg（2.0～2.8 kg）。按实验要求随机分为ESW组和对照组，每组9只。对照组单纯行ACL重建手术，而ESW组在ACL重建术后给予冲击波治疗。
1.2 动物模型的建立。
氯胺酮（2ml/支）和速眠新（1.5 ml/支），1∶1混合，按0.2 ml/kg肌注麻醉后，双后肢膝关节备皮，碘酒、酒精消毒，无菌手术巾覆盖。沿髌骨旁内侧缘做一纵行切口，长约2 cm，切开关节囊，将髌骨翻向外侧，暴露兔膝关节ACL，与周围组织分离后，切除ACL。从肌肉肌腱联合处以远切取趾长伸肌腱而股骨端附着处保留完整，趾长伸肌腱断端使用4—0 Ethibond缝合线编织缝合，并通过测量器测肌腱直径，采用与肌腱直径大小匹配的钻（2.0 mm）建立股骨、胫骨隧道，将趾长伸肌腱的远端拉入股骨隧道内，经关节腔，穿过胫骨隧道拉出，并在胫骨嵴上钻孔，膝关节屈曲30°位，将肌腱牵引线在胫骨桥上打结固定（图1）。术毕检查重建韧带张力完好，逐层缝合切口，并使用划线笔标记股骨和胫骨隧道部位。无菌敷料包扎伤口，实验动物不制动，放回饲养笼内。术后给予青霉素钠20 万u肌注3 d，每天检查实验动物的伤口及一般情况。
图1 兔趾长伸肌腱重建ACL的手术示意图。
1.3 治疗方法。
1.3.1 ESW组 使用瑞士EMS公司Dolorclast放射冲击波治疗机， ACL重建术后24 h在股骨隧道和胫骨隧道中部分别给予体外冲击波治疗，冲击波能流密度为0.16 mJ/mm2，冲击量为500次（4Hz，3.5 kPa）。
1.4 组织学评价。
1.4.1 墨汁灌注 术后2、4、8周时分别取实验兔6只，麻醉后，在一侧腹股沟区切开皮肤、皮下组织，游离股动、静脉，在股动脉向心插管，股静脉离心插管，放血至兔循环停止，同时往动脉内注入肝素生理盐水（每500ml生理盐水中加入肝素12 500 U）冲洗血管，直至静脉流出无色液体时为止，然后从股动脉注入配好的复合墨汁（中华墨汁、甲醛及生理盐水体积比为3∶1∶6，每只约250 ml），远端皮肤、趾甲均已变黑时结扎封闭静脉插管，当阻力增大肢体饱胀难以注入时停止灌注，封闭动脉插管保持血管内压力。通过墨汁灌注定量分析腱骨界面新生血管的含量，每一样本随机取5个部位使用Olympus DP70 microscope观测，在40×放大视野下、同一曝光条件下照相，图像分析使用Image—Pro Plus 5.0 image—analysis software (Media Cybernetics, Sliver Spring, MD, USA)，可计算出新生血管的含量。
1.4.2 HE和Masson三色染色 取材标本使用10％甲醛溶液固定72 h，接着用10％EDTA磷酸缓冲液脱钙1～1.5个月后，脱钙组织沿股骨隧道和胫骨隧道纵向切开，然后使用梯度酒精逐级脱水、清洗、石蜡包埋后，切成5 μm厚薄片，置于载波片上。HE染色观察骨—肌腱界面处组织愈合过程中各种细胞的生长情况及新生血管的变化，Masson三色染色观察骨—肌腱界面处胶原纤维增生、排列分布的变化。
1.5 统计学分析。
有数据均以平均数±标准差表示，对照组与ESW组新生血管含量的差别采用成组t检验进行统计学比较，使用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析 ，检验水准α=0.05。
2 结 果。
2.1 组织学观察。
术后2周：HE染色示对照组移植肌腱与骨隧道之间由新生肉芽组织填充，连接松散，其间可见间断性空隙。新生组织主要由少量血管、成纤维细胞和炎性细胞组成（图2a）；ESW组移植肌腱与骨隧道之间结合亦不紧密，其间填充组织成分主要由新生血管、成纤维细胞和炎性细胞组成（图2b）。Masson三色染色示对照组腱骨界面成纤维细胞增生，但胶原纤维含量少（图3a）；ESW组腱骨界面成纤维细胞大量增生，胶原纤维含量少、排列不规则（图3b）。
术后4周：HE染色示对照组肌腱移植物与骨隧道之间组织结合较紧密，其间填充组织血管含量较少、成纤维细胞和炎性细胞增多（图2c）。ESW组肌腱移植物与骨隧道之间出现瘢痕组织连接,结合紧密，填充组织主要为较多新生血管、大量的成纤维细胞和较少的炎性细胞。靠近肌腱侧主要为细胞核呈长梭形的成纤维细胞，而靠近骨隧道侧主要为细胞核呈类圆形的成软骨细胞，部分区域从肌腱到骨之间形成软骨组织移行带（图2d）。Masson三色染色示对照组腱骨界面成纤维细胞增生，胶原纤维合成增多但排列不规则（图3c）；ESW组腱骨界面成纤维细胞大量增生，胶原纤维含量明显增多，有的部位呈垂直纵向排列与软骨组织连接（图3d）。
术后8周：对照组肌腱移植物与骨隧道之间伴随成纤维细胞增生，胶原纤维合成增多、排列较规则，肌腱与骨隧道之间的连接变得紧密（图2e）。ESW组肌腱移植物与骨隧道之间由致密的结缔组织连接，胶原纤维大量合成而成纤维细胞、炎性细胞数量减少，胶原纤维排列规则，腱骨界面的部分区域出现胶原纤维—纤维软骨组织—骨组织的移行带改变，形成类似韧带直接止点样结构。（图2f）。Masson三色染色示对照组腱骨界面成纤维细胞数量减少，胶原纤维合成增多，排列较规则（图3e）；ESW组腱骨界面成纤维细胞数量减少，胶原纤维含量明显增多、排列规则，与周边骨隧道紧密连接（图3f）。
图2a 腱骨界面结合松散，由含少量血管的肉芽组织填充(HE 10×) 图2b 腱骨界面结合松散，由含少量血管的肉芽组织填充(HE 10×) 图2c 腱骨界面之间成纤维细胞增生，近骨隧道侧转变为类软骨细胞(HE 10×) 图2d 肌腱移植物与骨隧道之间结合紧密，胶原纤维排列整齐，腱骨界面新生血管明显增多(HE 10×) 图2e 腱骨界面结合较紧密，通过纤维结缔组织连接，新生血管含量较少(HE 10×) 图2f 腱骨界面软骨组织形成，肌腱与软骨通过垂直胶原纤维连接(HE 10×) 图3a 腱骨界面成纤维细胞增生，胶原纤维含量少(Masson三色染色10×) 图3b 腱骨界面成纤维细胞大量增生，胶原纤维含量少，排列不规则(Masson三色染色10×) 图3c 腱骨界面成纤维细胞大量增生，胶原纤维合成增加，但排列不规则(Masson三色染色10×) 图3d 腱骨界面胶原纤维大量增生，排列较规则(Masson三色染色10×) 图3e 腱骨界面成纤维细胞数量减少，胶原纤维合成增多、排列较规则(Masson三色染色10×) 图3f 腱骨界面胶原纤维大量增生、排列规则，与骨隧道紧密连接(Masson三色染色10×)。
对照组术后4、8周与术后2周相比腱骨界面新生血管的含量无显著差别，而ESW组4周时腱骨界面新生血管的含量较2周时显著增加，并持续至术后8周；术后4周和8周ESW组腱骨界面新生血管的含量均显著高于对照组（P0.05）。（如表1所示）表1 腱骨界面愈合组织新生血管所占的比例 P值*代表对照组与ESW组之间的比较，而P值**代表对照组和ESW组在不同时间点上的比较（术后4、8周与术后2周的比较）。
3 讨 论。
移植肌腱在骨隧道内的愈合是一个复杂的过程,以往研究认为肌腱移植物与骨隧道的连接方式包括两种即直接连接和间接连接。其中直接连接包含有典型的四层结构：纤维组织、非钙化纤维软骨、钙化软骨和骨组织，非钙化纤维软骨与钙化软骨之间有嗜碱性染色的潮线［1］；间接连接指肌腱与骨之间通过垂直胶原纤维即Sharpey纤维进行连接。但对腱骨间愈合最终是形成直接连接还是间接连接目前仍存在分歧［2～8］,也有学者认为腱骨间愈合是先形成间接连接，再逐渐向直接连接转化的过程［9］。