皂角皂苷对SMMC7721细胞Caspase3表达的影响
【摘要】 目的 探讨皂角皂苷对应用阿霉素后SMMC7721细胞Caspase3表达的影响。方法 MTT法检测单独应用阿霉素(DOX)或阿霉素与皂角皂苷联合作用的SMMC7721细胞的生存率;RTPCR检测Caspase3 mRNA表达。结果 与对照组相比，单独应用阿霉素组细胞的生存率未见明显变化;而阿霉素与皂角皂苷联合作用组细胞存活率显著降低，Caspase3 mRNA表达增高。结论 皂角皂苷可能通过上调Caspase3水平进而诱导SMMC7721细胞的凋亡，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
【关键词】 SMMC7721细胞;凋亡;Caspase3;皂角皂苷。
细胞凋亡的机制中，凋亡的细胞因子受体信号转导途径一直被人们所关注，尤其是细胞内蛋白水解酶(cysteinyl aspartatespecific proteases，Caspase)〔1〕。Caspase是目前公认的细胞凋亡后期的共同途径。本实验以SMMC7721细胞株为研究对象，利用特殊工艺从皂角皂苷中提取有效部位，通过检测细胞的生存率及Caspase3的表达，探讨皂角皂苷对SMMC7721细胞的诱导凋亡作用。
1 材料与方法。
1.1 材料 SMMC7721细胞株细胞由吉林大学第一医院提供。阿霉素、DAB购于Sigma，皂角皂苷由长春中医学院赠予，IMDM培养基和新生牛血清购于Hyclone，Trizol试剂购于Invitrogen，Caspase3引物和PCR试剂购于Takara。
1.2 SMMC7721细胞培养 SMMC7721细胞置于完全培养基(10% Hyclone新生牛血清，IMDM培养液pH7.4)中，37℃，5% CO2培养箱中培养。细胞在无阿霉素的条件下培养1 w后用于实验。细胞传代的浓度为5×105/ml。
1.3 亚甲基四唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)测定细胞生存率 取对数生长期的SMMC7721细胞。消化、离心，使成单细胞悬液，计数，以细胞数1.0×104/孔接种于96孔板中。24 h后，加入不同浓度的药物，单独应用阿霉素5 μg/ml及阿霉素5 μg/ml分别与皂角皂苷50、100 μg/ml联合应用。24 h后，每孔加入0.5 mg/ml的MTT液20 μl，4 h后弃掉培养液，每孔加150 μl DMSO，570 nm测其吸光度值。实验重复5次。
1.4 SMMC7721细胞Caspase3 mRNA的表达 同剂量药物作用24 h，SMMC7721细胞中总RNA提取参照UltraspecTMII RNA Isolation System(Biotecx Laboratories，INC)说明书进行，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，进行PCR反应。GAPDH引物序列为正义: 5′GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3′，反义:5′AAGAATGGGTGTTGCTGTTGAAGTC3′，片段大小700 bp。Caspase3引物序列为正义: 5′TTTGTTTGTGTGCTTCTGAGCC3′, 反义: 5′ATTCTGTTGCCACCTTTCGG3′，片段大小400 bp。PCR反应条件：变性94℃，30 s，退火59℃，30 s，延伸72℃，45 s。Caspase3为28个循环，GAPDH为25个循环。取PCR产物进行电泳，凝胶成像系统下观察并拍照。实验重复3次。
1.5 统计学处理 数据均以x±s表示，用SPSS11.0软件进行多组间ANOVA分析。
2 结 果。
2.1 阿霉素和皂角皂苷对SMMC7721细胞生存率的影响 阿霉素(5 μg/ml)单独作用于SMMC7721细胞时，细胞存活率(80%)与对照组(90%)比较无明显变化。皂角皂苷(50、100 μg/ml)单独作用于SMMC7721细胞时，细胞存活率也无明显变化。当阿霉素和皂角皂苷联合作用于SMMC7721细胞时，阿霉素5 μg/ml+皂角皂苷50 μg/ml组(52%)、阿霉素5 μg/ml+皂角皂苷100 μg/ml组(42%)与对照组或阿霉素组比较，细胞存活率明显下降(P0.01)。
2.2 阿霉素和不同浓度皂角皂苷作用SMMC7721细胞Caspase3 mRNA表达 RTPCR结果表明：阿霉素单独作用SMMC7721细胞时，与对照组相比Caspase3 mRNA表达未见明显差异;阿霉素和不同浓度皂角皂苷共同作用时，与对照组和阿霉素单独作用时相比Caspase3 mRNA表达明显增高(图1)。
1.对照组; 2.阿霉素5 μg/ml; 3.阿霉素5 μg/ml+ 皂角皂苷 50 μg/ml; 4.阿霉素5 μg/ml+皂角皂苷100 μg/ml。