胃癌caspase—3表达及其与细胞凋亡的关系研究

【摘要】 目的 研究caspase—3表达在胃癌发生发展中的作用。方法 采用免疫组化S—P法观察113例胃癌旁上皮细胞、原发灶癌细胞和浸润淋巴细胞以及转移灶癌细胞中caspase—3表达，TUNEL法检测上述组织的细胞凋亡，并分析原发灶癌细胞中caspase—3表达与胃癌临床病理特征的关系，并探讨caspase—3表达与细胞凋亡的关系。结果 caspase—3在50.4％(57/113)的胃癌旁上皮细胞中表达，高于原发灶癌细胞中的阳性率32.7％(37/113)(P0.05);caspase—3在胃癌原发灶浸润淋巴细胞中的阳性率为70.8％(80/113)，高于胃癌旁上皮细胞和原发灶癌细胞中阳性率(P0.05);58.1％(25/43)的转移灶癌细胞中caspase—3表达阳性，其阳性率高于对应原发灶癌细胞(34.2％，13/38)(P0.05);原发灶癌细胞中caspase—3表达与胃癌患者的年龄、性别以及胃癌肿瘤大小、浸润深度、转移、TNM分期、生长方式和分化程度无相关性(P0.05)。原发灶癌细胞和浸润淋巴细胞及转移灶癌细胞中细胞凋亡指数明显低于癌旁上皮细胞（P0.01）。结论 胃癌原发灶癌细胞中caspase—3表达下调和浸润淋巴细胞中caspase—3表达上调与胃癌发生有关，由caspase—3介导的细胞凋亡与胃癌的发生与发展有关。【关键词】 胃癌 caspase—3 病理学 凋亡。

【Abstract】 Purpose：To study the role of caspase—3 expression and apoptosis in carcinogenesis and progression of gastric cancer. Methods：Epithdial cells of mucosa adjacent to carcinoma, cancer ceils and infiltrating tymphocytes of primary foci and cancer cells of metastatic foci from 113 gastric cancers were studied using streptavidin—hiotin—immunoperoxidase immunohistochemistry with anti—caspase—3 antibody. Caspase—3 expression in cancer cells of primary foci was compared with the clinicopathological features of gastric cancer. The apoptosis index (AI) of the abpve—mentioned specimens was studied by TUNEL method. Results：There was high immunohistoreactivity to caspase—3 in epithelial cells of mucosa adjacent to carcinoma from 50.4% (57/113) of cases of gastric cancers. Despite no correlation with tumor size、invasive depth、metastases、differentiation、TNM staging、age and gender of patients (P0.05), the positive immunoreactivity to caspase—3 in cancer ceils of primary foci was found in 32.7%(37/113) of gastric cancer, less than that in adjacent epithelial cells (P0.05).Infiltrating lymphocytes in primary foci showed strong immunoreactivity in 70.8% (80/113) of cases, more than adjacent epithdial ceils or cancer cells of primary foci (P0.05). Caspase—3 expression in metastatic cancer cells was more frequently expressed in 58.1%(25/43) of metastasis than in cancer cells of corresponding primary foci (34.2%,13/38) (P0.05). The AI of Epithdial cells of mucosa adjacent to carcinoma was siginificantly higher than that of the cancer ceils and infiltrating tymphocytes of primary foci and cancer cells of metastatic foci (P0.01). Conclusions：Down—regulation of caspase—3 expression in cancer cells of primary foci and up—regulation of caspase—3 expression in their filtrating lymphocytes are associated with carcinogenesis of gastric cancer. The progress ion of gastric cancinoma is correlated with the frustrated apoptosis transferred by caspase—3. 【Key words】 gastric carcinoma caspase—3 pathology Apoptosis 胃癌仍然是中国乃至全世界多发肿瘤之一[1]。肿瘤的自主增殖和凋亡失控是其最本质的生物学特性，因此研究细胞凋亡在胃癌发生、发展中的重要作用是非常必要的。caspase—3，又称半胱氨酸蛋白酶32(cysteineproteaseP32，CPP32)。caspase—3基因是1994年Fermander—Alnemri等[2]利用RT—PCR技术从T淋巴细胞文库中筛选出来，当细胞接受刺激时，其经过系列反应被激活，进而参与切割多种死亡底物，导致细胞凋亡。因此，caspase—3的表达具有反映凋亡启动因素存在和凋亡发生的双重生物学效应。本文研究caspase—3在胃癌旁上皮细胞、原发灶癌细胞和浸润淋巴细胞以及转移灶癌细胞中的表达，并探讨原发灶癌细胞caspase—3表达与胃癌临床病理特征的关系。同时分析探讨caspase—3的表达与细胞凋亡之间的关系。 1 材料与方法 1.1 材料 江苏省泰兴市第二人民医院和苏州大学附属第一医院2003年9月～2008年2月胃癌手术标本113例，其早、中、晚期胃癌分别为26、34和53例，其中38例伴有淋巴结或脏器转移，其代表性转移灶为43个。所有病例的原发灶和43个转移灶标本均经10％福尔马林液固定，石蜡包埋，4/μm厚切片，HE染色，由两位病理医生确定病理诊断。胃癌的肿块大小、浸润深度、转移、生长方式、TNM分期和组织分型等临床病理特征均被描述。所有患者术前均未接受放、化疗。 1.2 方法 caspase—3兔抗人多克隆抗体购于Dako生物试剂公司，抗体的稀释倍数为1：100，羊抗兔S—P试剂盒购于北京中山生物试剂公司。PBS代替一抗为阴性对照。caspase—3蛋白定位在细胞质上，呈棕黄色颗粒。根据阳性细胞占计数细胞的百分比，将免疫组化结果分级如下：阴性(－)，5％；弱阳性 (+)，6％～25％；阳性(++)，26％～50％；强阳性(+++)，50％。TUNEL染色检测细胞凋亡:(1)组织切片脱蜡后,用新鲜配制的付甲醛液室温下固定30 min；(2)用PBS液洗3次，将玻片置于渗透液中4℃孵育2 min；(3)PBS液洗3次,干燥,加TNUEL反应试剂50μl置湿盒内室温反应60 min；(4)PBS液洗2次,室温干燥,加转换剂(conreter AP)50μl置湿盒内37℃温箱60 min；(5)PBS液冲洗3遍,加底物50μl室温下孵育10min；(6)苏木素复染，干燥,封片,光镜观察,用Well label solution 50μl替代TUNEL作阴性对照,用已知阳性结肠癌作阳性对照。 1.3 统计分析 用X2检验比较各组间率的差异，Spearman分析判断各组等级资料的相关性。所有数据均利用SPSSl0.0统计软件处理。 2 结果 2.1 caspase—3在胃癌旁上皮细胞、原发灶癌细胞和浸润淋巴细胞以及转移灶癌细胞中的表达 Caspase—3在50．4％(57/113)的胃癌旁上皮细胞中表达，高于原发灶癌细胞的阳性率32.7％(37/113)(P0.05)；caspase—3在胃癌原发灶浸润淋巴细胞中的阳性率为70.8％(80/113)，高于胃癌旁上皮细胞和原发灶癌细胞(P0.05)。58．1％(25/43)的转移灶癌细胞呈现caspase—3阳性表达，与对应原发灶癌细胞中阳性率34.2％(13/38)相比升高(P0.05)。 2.2 原发灶癌细胞中caspase—3表达与胃癌临床病理特征的关系 原发灶癌细胞中caspase—3表达与胃癌患者年龄和性别以及胃癌肿块大小、浸润深度、转移、TNM分期、生长方式和分化程度无相关性(P0.05)。 2.3 胃癌旁上皮细胞、原发灶癌细胞和浸润淋巴细胞及转移灶癌细胞中细胞凋亡指数变化 TUNEL染色为核着色,凋亡细胞核为深棕黄色。胃癌旁上皮细胞、原发灶癌细胞和浸润淋巴细胞及转移灶癌细胞中细胞凋亡指数变化见表3。 TUNEL染色结果显示:凋亡指数在原发灶癌细胞和浸润淋巴细胞及转移灶癌细胞中细胞凋亡指数明显低于癌旁上皮细胞（P0.01）。 3 讨论 Krajwska等[3]首次采用免疫组化方法检测caspase—3蛋白在人体各组织器官内的表达分布，发现它在体内各种细胞中广泛分布，主要存在于胞质中，但在淋巴结生发中心B细胞、胃小凹上部隐窝细胞和结肠上皮细胞等细胞核内也有阳性表达，提出了caspase—3对人体绝大部分细胞的生存和死亡有调节作用。本研究显示caspase—3在胃癌旁上皮细胞中表达率为50.4％，提示caspase—3可能在胃黏膜上皮细胞的增殖和凋亡平衡中起到重要调节作用。 李印等[4]研究发现贲门胃癌中caspase—3表达低于胃良性病变和癌旁上皮细胞，且与Ki—67标记的增殖指数呈负相关，与TUNEL标记的凋亡指数呈正相关，说明caspase—3表达参与胃癌凋亡和增殖的失衡过程。我们的研究结果显示原发灶癌细胞caspase—3阳性率低于癌旁上皮细胞(P0．05)，提示caspase—3表达下调参与胃癌发生过程，与文献报道结果一致[4—6]。此外，胃癌中caspase—3表达与胃癌患者的年龄和性别无相关性(P0.05)，提示胃癌中caspase—3表达无性别年龄差异。胃癌组织中caspase—3表达与其各种生物学行为均无相关性，提示caspase—3表达可能与胃癌的生长、浸润和转移无关，仅是反映胃癌发生的生物学指标。 本研究结果同时显示caspase—3在胃癌原发灶浸润淋巴细胞中阳性表达率显著高于胃癌旁上皮细胞和原发灶癌细胞(P0.05)，而caspase—3在胃癌原发灶癌细胞中表达下调，因此大部分病例表现为癌细胞中caspase—3缺乏或低表达，而浸润淋巴细胞强表达。有学者发现肿瘤细胞中FasL表达升高，肿瘤本身多表达可溶性Fas而非膜型Fas，癌细胞表面大量的膜型FasL与浸润淋巴细胞表面的Fas结合，进而诱导淋巴细胞的凋亡，这些构成了肿瘤免疫逃逸的分子机制[7,8]。有文献报道，当FasL启动细胞凋亡时，Fas/FasL信号系统中起到关键作用的caspase—3则被活化，而后者发挥凋亡执行作用[3]。本研究结果支持caspase—3为免疫逃逸机制中效应因子的观点[9]。