嵌合体防龋疫苗的研究进展

摘要　嵌合体防龋疫苗是将变链球菌的毒力因子葡糖基转移酶和表面蛋白，或分别与霍乱毒素亚单位相嵌合，依据嵌合方式不同，分化学嵌合、基因工程嵌合、直接嵌合基因免疫。

对不同方式嵌合防龋疫苗的研究，有助于比较疫苗的有效性，为免疫防龋提供理论依据。

嵌合体疫苗是指两个及两个以上的抗原蛋白通过化学共价键结合，或间接通过基因工程方法获得嵌合抗原蛋白，以及运用含有嵌合基因的真核表达质粒直接免疫，诱发机体产生针对多种抗原的保护性免疫。

变链球菌是主要致龋菌，其重要毒力因子为葡糖基转移酶（glucosyltransferases,GTFs）和表现蛋白。

GTFs和表现蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性，是目前研究防龋疫苗较理想的抗原蛋白。

口腔中的抗体主要来自唾液腺的S—IgA和少量的血清IgG,S—IgA的形成需通过共同粘膜免疫系统。

在机体的粘膜组织附近分布着大量的淋巴组织，这些粘膜相关淋巴组织在刺激部位接受抗原刺激后，致敏淋巴组织通过游走，归巢而达到其他部位的粘膜组织，即效应部位，并合成、分泌特异抗体。

诱发粘膜免疫，产生高效、持久的S—IgA是近来嵌合体防龋疫苗研究的主要方向。

本文依据获得嵌合体抗原蛋白的不同方式，分别概述嵌合体防龋疫苗的研究现状。

1变链球菌表面蛋白（AgⅠ/Ⅱ）与霍乱毒素B亚单位（choleratoxinBsubunit,CTB）嵌合疫苗 　　近年来研究发现，CTB是有很强的粘膜免疫增强作用，不少学者将AgⅠ/Ⅱ与CTB化学偶联，以此嵌合体免疫动物，获得了明显的防龋效果. 　　AgⅠ/Ⅱ包括两个重复氨基酸序列，一个位于N端，富含丙氨酸，称A区，又称唾液成分结合区（salivabindingregion,SBR），一个位于C端，富含脯氨酸[4]。

霍乱毒素由B亚单位和A亚单位构成，其中A亚单位由两段肽构成，A1为毒性亚单位，A2与A1和B之间起桥梁联接作用。

B亚单位与哺乳动物细胞膜成分GM1神经节苷脂有强亲和力，是其作为粘膜免疫佐剂的结构基础。

目前AgⅠ/Ⅱ与CTB化学偶联的方法是CTB和AgⅠ/Ⅱ分别与N—Succinimidyl(3—[2—Pyriyl]—dithio)propionate(SPDP)结合，形成CTB—SPDP，AgⅠ/Ⅱ－SPDP,在室温又与二硫苏糖醇混合，再经还原和平衡过柱，获得的AgⅠ/Ⅱ溶液与等摩尔的CTB—SPDP混合，最后经透析得到AgⅠ/Ⅱ—CTB嵌合蛋白。

通过ELISA证实嵌合体结合GM1神经节苷脂的能力及AgⅠ/Ⅱ的免疫活性[5]。

Katz用相同方法获得的AgⅠ/Ⅱ—CTB经鼻腔免疫的Fischer鼠，与经口感染变链菌的相同鼠为对照，经ELISA测定，免疫组抗AgⅠ/Ⅱ的S—IgA为对照组的4倍，且免疫组小鼠下颌牙菌斑中的变链菌和龋均明显低于对照组[6]。

同样Russell用AgⅠ/Ⅱ—CTB经口免疫大鼠，经2—3次免疫，鼠产生抗AgⅠ/Ⅱ的S—IgA，至5—6月时仍能用ELISA检测出S—IgA[7]。

2　因工程嵌合疫苗 　　2.1　AgⅠ/ⅡA区与GTFs基因工程嵌合疫苗 　　GTFs是由1500个氨基酸组成的具有高度同源序列的蛋白质，其N端为蔗糖结合区（sucrosebinding,SB）,C端为葡聚糖结合区（glucanbinding,GB）[8]。

Yu等[9]用基因重组方法获得了AgⅠ/Ⅱ的A区与GTF的SB区或GB区嵌合的抗原蛋白，方法为：经PCR分别获得编码GTF—SB区、GTF—GB区和AgⅠ/Ⅱa区的基因，分别将编码GTF—GB区段和GTF—SB区段的基因插入质粒pBluescriptⅡ，得到质粒pBlueGB、pBlueSB，编码AgⅠ/ⅡA区的基因插入质粒pACA202。

质粒pBluegB，pBlueSB以相同内切酶酶切，分别插入pACA202得到含有嵌合基因的质粒，再插入原核表达质粒，最后得到含有嵌合基因AgⅠ/ⅡA区—GB，AgⅠ/ⅡA区—SB的表达质粒pQEPG22,pQEPG23,转染E.colix—li—Blue。

得到的表达产物免疫兔后发现，用AgⅠ/ⅡA区—GB免疫产生的IgG既能抑制葡聚糖的合成，又能抑制变链菌对唾液包被的羟基磷灰古的非蔗糖依赖型粘附。

而用AgⅠ/ⅡA区—SB免疫产生的抗体不能抑制葡聚糖的合成，只能抑制非蔗糖依赖型粘附。

推测可能是抗AgⅠ/ⅡA—SB的抗体不能进入结合GTFs的催化区，或不能识别GTFs的构象[10]。

2.2　GTF—SB区与CTB基因工程嵌合疫苗 　　1996年，Laloi[11]先人工合成编码GTF的SB区基因的寡核苷酸序列，将此序列插入质粒pVA1542（不含启动子，含ctb基因），得到含有编码SB—CTB基因的嵌合质粒，最后将此嵌合基因插入带有启动子的表达载体pT—7—7，构建出表达载体PT7，将pT7转染E.coli，获得的表达产物免疫兔后产生了既抗GTFs，又抗CTB的抗血清，且抗血清能抑制50%的GTFs的酶活性。

2.3　AgⅠ/Ⅱ与CTA2B基因工程嵌合疫苗 　　1995年，Hajishengallis等[12]将编码变链菌AgⅠ/Ⅱ唾液结合区（sucrosebindingregion,SBR）的基因与编码霍乱毒素A2B亚单位的基因嵌合，其嵌合质粒的构建为：以含有霍乱毒素基因的质粒pRIT1080为模板，设计有XhoⅠ、Bpul1021酶切位点的引物，得到编码A2B亚单位的基因克隆，再亚克隆入含有XhoⅠ、Bpul1021酶切位点的质粒pET206，得到重组质粒pCT△A1，再以含有AgⅠ/ⅡsBR基因的质粒为模板，在引物设计中分别加入Ncol,xhoⅠ酶切位点，得到编码SBR的基因克隆，再插入质粒pCT△A1，得到嵌合质粒pSBR—CT△A1，转染E.coli，表达产物经ELISA检测，既有结合GM1神经节苷脂的能力，又保留了SBR的抗原性，经口免疫小鼠，诱导出高滴度的抗AgⅠ/Ⅱ的S—IgA和血清IgA，且持续3—6月。