耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药特征及耐消毒剂基因的检测分析
; 作者：颜英俊 糜祖煌 刘华 杨洋 张凯 杨明清 黄文方。
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【摘要】; 目的 分析和调查我院2005年1月～12月临床分离34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗生素耐药特点以及耐消毒剂相关基因携带状况。方法 应用BD Phoenix100全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和17种药物敏感试验，头孢哌酮/舒巴坦采用KB法。用PCR方法检测季胺类(如苯扎溴铵)、双胍类(如氯己定)耐药相关基因qacEΔ1?sul1。结果 亚胺培南耐药铜绿假单胞菌除对阿米卡星100%敏感外，对哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦敏感率为48%～54%，对第三代及第四代头孢菌素、氨曲南和喹诺酮类等抗菌活性差，敏感率为3%～29%，对美罗培南敏感率为29%，对氨苄西林/舒巴坦、氯霉素、四环素、复方磺胺甲口恶唑全部耐药。34株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌有14株qacEΔ1?sul1基因阳性，携带率为41.2%。结论 本组亚胺培南耐药铜绿假单胞菌除对阿米卡星敏感外，对其它常用抗生素耐药严重，且耐消毒剂相关基因阳性携带率较高，应引起临床微生物和消毒界的重视。 毕业论文。
【关键词】; 铜绿假单胞菌 亚胺培南 消毒剂 耐药基因 毕业论文。
; Investigation on the antimicrobial resistance characteristics 毕业论文。
ABSTRACT; Objective; To investigate the antimicrobial resistance characteristics and the condition of disinfectant?resistant gene (qacEΔ1?sul1) in 34 imipenem?resistant Pseudomonas aeruginosa.; Method; Thirty?four strains from patients from Jan to Dec 2005 were identified and drug susceptibility test were performed by BD Phoenix100 automatic microbial analysis system, cefoperazone/sulbactam susceptibility test was performed by Kirby?Bauer method. The qacEΔ1?sul1 gene was detected by PCR method.; Results; Imipenem?resistant Pseudomonas aeruginosa were all susceptible to amikacin, 48%～54% were susceptible to piperacillin and pipercillin/tazobactam,respectively. Only 3～29% were susceptible to the other cephlosporins, aztreonam and quinolones. There were 29% of Pseudomonas aeruginosa susceptible to meropenem and all resistance to amoxicillin/clavulanate, chloramphenicol, tetracycline and trimethoprim/sulfamethoxazole. Fourteen of 34 strains were qacEΔ1?sul1?gene positive, and the carrying rate was 41.2%.; Conclusion; The resistance status of Pseudomonas aeruginosa to imipenem is serious. There is high positive percentage of qacEΔ1?sul1 gene in imipenem?resistant Pseudomonas aeruginosa.
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; KEY WORDS; Pseudomonas aeruginosa Imipenem Disinfectants Resistance gene 毕业论文。
; 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是临床上常见的、重要的条件致病菌，同时也是医院感染常见的和主要致病菌。铜绿假单胞菌可引起多种感染，对多种常用抗生素耐药，给临床治疗带来很大的困难。碳青霉烯类抗生素(如亚胺培南)以其广谱的抗菌活性，被临床广泛用于治疗重症感染。但近年来，由于外膜蛋白D2缺失、产酶、外排泵、生物膜等耐药机制［1，2］，铜绿假单胞菌对亚胺培南的敏感性逐年下降。2005年黄支密等［3］从多重耐药MRSA中发现耐消毒剂基因qacA。细菌耐消毒剂为获得性的qac基因所致，其中qacE?sul1基因由整合子介导，可被革兰阳性和革兰阴性菌广泛获取［4，5］。为了解我院耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IMPRPa)的耐药特点及消毒剂?磺胺耐药相关基因(qacEΔ1?sul1)存在状况，我们进行了相关分析和研究，现总结报告如下。 毕业论文。
; 1; 材料和方法。
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; 34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌来自于2005年1月～12月我院住院患者的临床分离标本(包括痰液、尿液、伤口分泌物、脓液、血液等)。 毕业论文。
; 铜绿假单胞菌ATCC27853和大肠埃希菌ATCC25922购自卫生部菌种保藏中心。 毕业论文。
; 所有菌株均以BD Phoenix100全自动微生物分析仪鉴定到种，必要时采用ATB或传统生化方法补充鉴定。采用BD Phoenix100配套药敏试验复合板，包括阿米卡星、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢噻肟、头孢他啶、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、美罗培南、哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦、头孢吡肟、四环素和复方磺胺甲口恶唑共16种抗生素，头孢哌酮/舒巴坦采用KB法，药敏标准按2005年版CLSI/NCCLS M100?S15规定执行。 毕业论文。
; 1.4; 主要仪器设备与试剂 毕业论文。
; Eppendorf centrifuge 5417R低温离心机，恒温金属浴(杭州大和公司)，MJ Peltier Thermal Cycler(MJ Research)，Bio?RAD电泳仪，Bio?RAD凝胶成像系统，琼脂糖(Oxoid公司)，100bp DNA Ladder Marker(大连宝生物工程公司)，6×上样缓冲液(北京天为时代公司)，头孢哌酮/舒巴坦药敏纸片(Oxoid公司)。 毕业论文。
; 1.5; 模板DNA提取。
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; 采用蛋白酶K消化法。 毕业论文。
; 按美国国立生物技术信息中心(NCBI)已登陆的qacEΔ1基因序列(登陆号U12338)自行设计引物，P1：5′?TAGCGAGGGCTTTACTAAGC?3′，P2：5′?ATTCAGAATGCCGAACACCG?3′，扩增产物为300bp。优化后的PCR反应体系为：P1、P2引物各0.5μmol/L，dNTPs各200μmol/L，KCl 10mmol/L(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，Tris?HCl(pH9.0)10mmol/L，NP40 0.5%，Taq DNA聚合酶1U。全部反应体积20μl，其中模板液5μl。热循环参数为：93℃预变性3min→93℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，最后一个72℃延伸5min，共循环35周期。纯水为阴性对照。耐药基因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。 毕业论文。
; 1.7; 结果判断 毕业论文。
; 取10μl扩增产物与2μl 6×上样缓冲液混匀，点样于1.5%琼脂糖凝胶，在100V电压电泳30min，出现300bp的条带即为qacEΔ1?sul1基因阳性。用凝胶成像系统观察并照相。 毕业论文。