钙离子对小鼠海帕西啶mRNA表达的影响

作者：郭晓强 肖维富 杨勇 姚清国。

【摘要】 目的 研究钙离子在海帕西啶表达调节中的作用。方法 昆明小鼠被分为4组，分别腹腔注射等渗的NaCl、MgCl2、CaCl2和FeCl3溶液，采集血清和肝脏组织，血清铁和总铁结合力使用试剂盒检测，肝脏海帕西啶mRNA含量使用半定量RTPCR确定。结果 和钠离子相比，钙离子可减少血清铁含量（P＜0.05），同时抑制海帕西啶mRNA表达（P＜0.05）。结论 钙离子可通过调节海帕西啶mRNA表达而影响铁代谢。

【关键词】 钙离子；海帕西啶；铁代谢。

铁是机体生长发育所必需的微量元素，参与生物氧化和DNA复制等生物学过程，然而铁过多可造成生物损伤。海帕西啶（hepcidin）是2000年发现的一种主要在肝脏内表达、具有铁调节功能的小肽〔1〕，可通过诱导小肠上皮细胞或巨噬细胞表面铁输出蛋白（ferroportin1,Fpn1）细胞内吞和降解而达到减少血清铁的目的〔2〕。海帕西啶表达受多种因素影响，如炎症和铁沉积可诱导表达，而贫血和缺氧则抑制其合成〔3〕。一系列研究发现海帕西啶表达还受骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）的影响〔4〕，而BMP蛋白参与了骨骼形成过程，而钙离子是骨骼形成的基本离子之一。随着年龄相关的骨质疏松发生率增加的同时铁却出现沉积现象，这一系列结果说明铁内稳态可能与机体钙代谢之间存在密切联系。本实验探索小鼠腹腔注射不同阳离子后检测海帕西啶mRNA表达和血清铁的变化，以确定钙离子对机体铁内稳态的影响。

1 材料与方法。

1.1 动物与试剂 实验用昆明雄性小鼠（清洁级）购自河北省实验动物中心〔合格证号:SCXK(冀)20031003〕，体重20 g左右；RNA提取试剂盒（Trizol试剂盒）、禽类成髓细胞病毒（AMV）逆转录酶、焦碳的二乙酯（DEPC）等均购自上海生工，其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法。

1.2.1 分组与处理 16只小鼠分为4组，分别腹腔注射等渗的NaCl（0.154 mol/L）、MgCl2(0.103 mol/L)、CaCl2(0.103 mol/L)和FeCl3(0.077 mol/L)，每日1次，除FeCl3注射1 d（毒性太大，注射过多可导致死亡）外，其他均连续注射1 w。

1.2.2 取材 取材前12 h，小鼠禁食以减少肝糖原积累。腹腔注射0.4％戊巴比妥钠麻醉后，剖开腹腔，心脏取血以制备血清，然后使用DEPC处理后的生理盐水心脏灌流，完毕后取适量肝脏组织放入Trizol中进行RNA提取。

1.2.3 小鼠血清铁和总铁结合力测定 使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒按照说明书完成。

1.2.4 小鼠肝脏海帕西啶和β肌动蛋白（βactin）的mRNA RTPCR检测 将提取的RNA首先测定浓度，利用逆转录获得cDNA，然后对海帕西啶和βactin进行PCR 扩增22 个循环（94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min），将PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，所得结果用凝胶成像系统扫描并计算吸光度值。实验中所用基因的PCR引物均为上海生工甗物工程技术有限公司合成，其序列分别为：海帕西啶：前向：5′CCTATCTCCATCAACAGATG3′；反向：5′AACAGATACCACACTGGGAA3′；βactin：前向5′AGCCATGTACGTAGCCATCC3′；反向：5′TTTGAGGTCACGCACGATTT3′。

1.3 统计学处理 数据资料用x±s表示，海帕西啶和βactin的mRNA相对含量（RTPCR后电泳吸光度比值并选取NaCl组为100）用柱形图显示，应用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析。

2 结果。

2.1 不同离子对小鼠血清铁和总铁结合力的影响 相对于NaCl组，注射MgCl2组可略升高血清铁含量，但差异不显著；而注射CaCl2组则使血清铁明显下降（P＜0.05）；注射FeCl3组则显著增加血清铁含量（P＜0.05）。计算表明，只有注射CaCl2组可明显减少转铁蛋白饱和度（P＜0.05），另外两种离子组则影响不显著（P＞0.05）。见表1。