苦参碱诱导人肝癌细胞株HpG2.2.15凋亡的实验研究
【摘要】 目的研究苦参碱诱导人肝癌细胞株HpG2.2.15的凋亡机制。方法使用MTT法测定细胞生长率，流式细胞仪检测细胞凋亡和Fas蛋白的表达，RT—PCR检测Fas基因的表达。结果苦参碱对人肝癌细胞株HpG2.2.15的生长抑制率为75.5%。苦参碱具有诱导HpG2.2.15细胞凋亡的作用，诱导细胞凋亡率为57.9%。苦参碱诱导人肝癌细胞株HpG2.2.15Fas基因的表达率（4.11%）优于对照组DDP（3.7%）。苦参碱可使细胞株的Fas蛋白表达增加。结论苦参碱具有诱导HpG2.2.15细胞凋亡的作用，其作用是促进Fas基因的表达，使Fas蛋白增加。
【关键词】 HpG2.2.15细胞株； 苦参碱 ； 凋亡； 凋亡蛋白。
乙肝病毒与肝癌发生密切相关，两者相关率高达80％，在肝细胞癌中，血清HBV阳性感染率为94.78％；HBsAg阳性携带率为89.57％［1］。HBV—DNA与肝细胞DNA紧密结合在一起，乙肝病毒产生的X蛋白在肝癌的发生和发展中起着重要的作用。苦参碱可诱导人肝癌细胞株HpG2凋亡，应用全基因组表达谱芯片检测差异表达基因，苦参碱可改变人肝癌细胞株HpG2细胞基因谱，调控凋亡基因的表达，在苦参碱治疗的C6细胞株中，57个基因表达上升2倍，而11个基因至少下调2倍［2，3］。苦参碱可诱导wp53的表达，从而激活Bax基因，抑制Bc1—2基因；并且wp53还可能诱导Fas的表达，最终导致细胞凋亡［4］。苦参碱促进HpG2细胞Bax的表达，抑制Bcl—XL 和Bcl—2蛋白的表达，说明苦参碱可通过抑制HepG2细胞内Bcl—2/Bcl—XL的活性，减少细胞色素C的释放，激活caspase—3蛋白进而激活caspases蛋白酶家族，诱导细胞凋亡的发生［5］。 HpG2.2.15细胞株是将乙肝病毒X基因转染到HpG2细胞株内所得，更符合中国人乙肝诱发原发性肝癌的发病特点。本实验研究苦参碱对人HpG2.2.15细胞株的作用。
1 材料。
1.1 细胞株人HpG2.2.15细胞株，由本实验室保存。在含10％胎牛血清的DMEM培养液中，37℃，5％CO2条件下培养。
1.2 试剂苦参碱注射液5 ml∶50 mg，江苏吴中医药集团有限公司，批号070604。MTT和G418购自sigma 公司，胰蛋白酶和Fas抗体购于sigma 公司。DAB试剂盒购自天津灏洋生物公司，ABC—Kit试剂盒购自sigma公司。兔抗人HBxAg多克隆抗体（HBx99 rabbit pdycolonal AB serum，Rabbit 2）由本实验室保存。
1.3 仪器酶标仪（美国Bio—Rad公司680）， BD FACSCanto流式细胞仪，电泳仪(美国Bio—Rad公司)，紫外透射仪(美国Bio—Rad公司)。
2 方法。
2.1 MTT实验法①MTT用PBS配制成5 mg/ml。②细胞悬液以104/孔接种于96孔培养板（200 μl/孔），治疗组每孔加入苦参碱10μl（200 μg/ml），对照组DDP10 μl（20 μg/ml），空白组加入培养液10 μl/孔。③在37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h。④每孔加入MTT20 μl，每次3孔，37℃作用4 h。⑤吸弃各孔中的上清，每孔加入DMSO 150 μl，振荡，紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在波长540 nm处测定吸光度A值。⑥上述试验重复4次。
2.2 流式细胞学检测法①对数生长期的细胞，胰酶消化后，以5×104/ml的密度接种，贴壁后加入DMEM培养基培养24 h，治疗组加入苦参碱10 μl（200 μg/ml），对照组加入顺铂10 μl（20 μg/ml），空白组加入等体积的培养液。②继续培养48 h，胰酶消化成单细胞悬液，冰PBS 洗涤2次，800 r/min离心5 min，弃上清，缓慢加入—20℃预冷的70%乙醇，4℃过夜。③取细胞悬液，PBS洗涤，1 600 r/min离心5 min后，弃上清。PI 染液1.0 ml染30 min，混合液经过300目滤网以除去杂质，620 nm 检测。每样本收集多于10 000个荧光信号。④在流式细胞仪上作Fas基因表达分析。将细胞培养后直接将细胞送至流式细胞室做检查。
2.3 RT—PCR试验方法。
2.3.1 引物序列Fas—F5‘—TCCTACCTCTGGTTCTTAC—3‘Fas—R5‘—CTCTTCACTTCCTCTTTGC—3‘Beta—actin F5‘— ACTCTTCCAGCCTTCCTT—3‘ Beta—actin R5‘— ACTCGTCATACTCCTGCT—3‘。
2.3.2 逆转录过程（RT）试剂：5×AMV buffer RNA酶抑制剂 随机引物 DNTPs AMV RT反应体系20 μl灭菌的DEPC水10.3 μl5×AMV buffer4 μlRNA抑制剂0.4 μlOligo(DT) 1 μldNITs1.3 μlRAN2 μlAMV 1 μl。
2.3.3 反应条件37℃90 min，95℃10 min，4℃pause。PCR 反应体系25 μl dH2O14 μl10×PCR Buffer2.5 μldNTPs1.2 μlPrimer11.2 μlPrimer21.2 μlTemplate4 μlTaq 酶0.8 μl。
2.3.4 PCR反应程序95℃4 min → 95℃40 s → 54℃30 s → 72℃30 s →72℃5 min →4℃ pause。