缬沙坦对扩张型心肌病心衰大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白的影响

作者：张赢予 张馨木 苏兆亮 李卫东 尹春阳 陈建华 张国辉。

【摘要】 　　目的 观察缬沙坦(Val)对扩张型心肌病(DCM)心衰大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白的影响。方法 SD大鼠完全随机分为3组：模型组(DCM组，n=15)，Val组(DCM+Val组，n=15)，对照组(C组，n=10)。DCM组及DCM+Val组给予阿霉素腹腔注射，DCM+Val组给予缬沙坦灌胃。8 w后，采用Western印迹法、免疫组化检测心肌组织中凋亡相关蛋白的表达情况，TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数(CMAI)。结果 ①Western 印迹结果显示，DCM组和DCM+Val组大鼠心肌组织中VDAC、Smac蛋白相对表达水平显著高于C组（均P0.05）；与DCM组相比，DCM+Val组大鼠心肌组织中两种蛋白的表达水平显著下降（均P0.05）。②免疫组化结果显示，DCM组和DCM+Val组VDAC、Smac阳性细胞数显著多于C组；与DCM组相比，DCM+Val组两种蛋白阳性的细胞数显著减少。③TUNEL检测结果显示， DCM组和DCM+Val组大鼠CMAI与C组相比显著升高（均P0.05）；与DCM组相比，DCM+Val组大鼠CMAI有所降低，但差别无统计学意义（P﹥0.05）。结论 Val 对DCM心衰大鼠心肌细胞的凋亡有抑制作用。

【关键词】 缬沙坦；扩张型心肌病；凋亡。

美国国立卫生院（NIH）制订的心血管疾病战略，鼓励从凋亡等方面，将心力衰竭和扩张型心肌病(DCM)的分子细胞机制联合研究〔1〕。血管紧张素Ⅱ1型受体（angiotensin II type 1 receptor，AT1R）拮抗剂缬沙坦（Valsartan，Val）对于治疗老年心力衰竭、自发性高血压能够有效抑制心肌细胞凋亡〔2～6〕，在心肌缺血再灌注损伤中也能减轻心肌细胞凋亡，减轻缺血再灌注损伤，保护心脏〔7〕。而Val对于DCM心肌细胞凋亡的影响及其相关机制尚未见系统研究。本研究通过观察Val对DCM心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响，探讨Val降压外的心脏保护作用机制。

1 材料与方法。

1.1 实验动物。

健康雄性SD大鼠，8周龄，体重220～260 g，由江苏大学实验动物中心提供〔许可证号：SYXK(苏)20080024〕。

1.2 实验仪器及试剂。

X22R型冷冻离心机(美国Beckman公司)，匀浆机(德国IKA公司)，冰冻切片机、荧光倒置显微镜(德国Leica公司)，垂直电泳仪（美国BioRad公司）。阿霉素(浙江海正药业有限公司，批号：070301)，Val(北京诺华制药有限公司，批号：080401)，氯胺酮(江苏恒瑞医药有限公司，批号：HK071105)。试剂：考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程有限公司，批号20090511)，甘露醇、蔗糖、琥珀酸(Sigma公司)，Hepes(Amresco公司)，EDTA(上海五联化工厂)，Tris(上海润捷化学试剂有限公司)。

1.3 动物分组及处理。

将40只SD大鼠完全随机分为模型组(DCM组，n=15)，Val干预组(DCM+Val组，n=15)和对照组(C组，n=10)。DCM组及DCM+Val组给予阿霉素(2 mg/kg,1次/w)腹腔注射，C组给予相同体积生理盐水腹腔注射。DCM+Val组每日给予Val(30 mg/kg)灌胃给药，DCM组及C组给予同体积生理盐水灌胃，持续给药8 w。于第8周实验结束时麻醉大鼠，采血后迅速取出心脏，一部分4%中性甲醛固定，另一部分用生理盐水制成10%组织匀浆，测定相关指标。

1.4 Western印迹检测VDAC、Smac蛋白的表达。

采用Western印迹检测电压依赖阴离子通道（voltagedependent anion channels,VDAC）、第二个线粒体来源的胱氨酸酶激活剂(second mitochondriaderived activator of caspase,Smac)蛋白表达情况。步骤如下：提取各组大鼠心肌组织总蛋白，Bradford法进行蛋白定量后进行SDSPAGE，电泳结束后将蛋白转印至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST 4℃封闭过夜，TBST洗涤。一抗孵育过夜，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，洗涤后用ECL plus显色，Typon多功能激光扫描成像系统扫描，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值，相对灰度值的计算为各蛋白与内参βactin的比值，表示蛋白的相对表达水平。

1.5 免疫组化染色法检测VDAC、Smac蛋白的表达。

各组大鼠心肌组织固定24 h，常规石蜡包埋、切片，厚度约4～5 μm，贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，采用免疫组化SP法检测VDAC、Smac蛋白的表达。判定标准：阳性细胞胞浆呈棕褐色，着深棕色者为强阳性表达细胞，不着色者为阴性表达细胞，介于两者之间者为弱阳性表达细胞。

1.6 心肌细胞凋亡指数(cardiac myocyte apoptosis index，CMAI)的检测。

采用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)检测各组石蜡切片CMAI，参照文献方法〔8〕，按照试剂盒说明书操作。200倍光镜下观察结果，每张切片随机选择5个高倍镜视野，计数视野中凋亡阳性染色的心肌细胞数及心肌细胞总数的比例即CMAI。判断标准：核蓝染者为阴性细胞，即未发生凋亡的正常心肌细胞；胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。按公式计算：CMAI =阳性细胞数／心肌细胞总数×100％。

1.7 统计学方法。

所有数据用 SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析（oneway ANOVA），计量资料数据以x±s表示，多组间均数比较采用StudentNewmanKeuls法。