牙龈卟啉单胞菌相关牙周炎疫苗有效免疫原及其途径和佐剂
[摘要]牙龈卟啉单胞菌细胞表面的多种抗原可诱导机体产生保护性免疫应答，阻止牙龈卟啉单胞菌定植和感染，因此选择合适的牙龈卟啉单胞菌有效免疫原作为疫苗候选抗原来防治牙周炎具有重要的研究价值。
牙龈卟啉单胞菌细胞膜上的菌毛蛋白、牙龈蛋白、血凝蛋白、外膜蛋白、被膜蛋白和热休克蛋白等多种表面抗原，皆有可能成为牙龈卟啉单胞菌相关牙周炎疫苗有效免疫原。
牙周炎疫苗研究常用的免疫途径有腺体免疫、黏膜免疫、皮下接种和肌肉注射等，学者们普遍认为，黏膜免疫应该成为牙周炎疫苗免疫的主要方式。
另外，牙周炎疫苗中使用佐剂可刺激机体产生免疫应答，增强抗原免疫原性。
在未来的牙周炎疫苗研究中，应该结合牙龈卟啉单胞菌的多种特异性抗原找到各血清型牙龈卟啉单胞菌共同的抗原决定簇，结合其他牙周致病菌的有效免疫原及选择最有效的免疫途径和使用抗原呈递和佐剂系统。
毕业论文网 [关键词]牙周炎；牙龈卟啉单胞菌；疫苗；有效免疫原；免疫途径；佐剂 [中图分类号]R 781.4 [文献标志码]A [doi]10.7518/gjkg.2015.03.020 牙龈卟啉单胞菌是牙周炎病变区及活动部位最主要的优势菌，牙周炎的发生发展和治疗后复发加重皆与之密切相关。
当下的基础治疗、药物治疗和手术治疗等仍然无法彻底治愈牙周炎，故牙周炎预防尤为重要。
牙周炎患者血浆和龈沟液中存在着的特异性微量抗体，可诱导机体产生微弱的免疫应答，尽管其不足以阻止感染，但却提示以疫苗诱导机体产生足够的抗体来阻止牙周炎的发生发展具有可行性。
研究证实，牙龈卟啉单胞菌细胞表面的多种抗原可诱导机体产生保护性免疫应答，阻止定植和感染，因此选择合适的有效免疫原作为疫苗候选抗原来防治牙周炎具有重要的研究价值。
1.牙龈卟啉单胞菌相关牙周炎疫苗的有效免疫原 细胞膜上含有菌毛蛋白（fimbria，Fim）、牙龈蛋白、血凝蛋白（hemagglutinin，HA）、外膜蛋白（outermembraneprotein，OMP）、被膜蛋白和热休克蛋白（heat shock protein，HSP）等多种表面抗原。
1.1菌毛蛋白 Fim是菌体表面卷曲的丝状蛋白附属器，是重要毒力因子，主要包括相对分子质量4.1×10的FimA和相对分子质量6.7×10的轻微菌毛蛋白1两种亚型，FimA是其主要亚型。
牙龈卟啉单胞菌对牙周组织的黏附是其定植于口腔进而致病的先决条件，Fim在该黏附过程中起重要的作用。
FimA既能与宿主细胞表面分子特异性的结合，促进细菌定植于口腔环境；又能与其他菌体表面蛋白结合，介导细菌定植于牙菌斑内，促进菌斑生物膜成熟。
无fimA基因的变异不能黏附和侵入宿主细胞，不能感染小鼠使之产生牙周疾病和动脉硬化。
在免疫动物的研究中，其血清中检测到的Fim特异性IgG可明显抑制牙龈卟啉单胞菌在仓鼠牙表面的定植。
Koh等发现，纯化的Fim或合成的菌毛肽可干扰细菌黏附到唾液包被的羟磷灰石上，若免疫机体，则可产生保护性免疫。
2010年于飞等在体外成功地构建人细胞毒性T细胞相关抗原4信号肽（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA4）引导的靶向牙周炎DNA疫苗pCTLA4fimA，证实其能在真核细胞COS7中正确表达和分泌，且具备免疫原性。
2011年他们用pCTLA4—fimA、pfmA、蛋白C抑制剂（protein c inhibitor，pCI）经鼻黏膜免疫小鼠，结果pCTLA4—fimA组血清IgG和分泌型IgA（secretory IgA，slgA）抗体滴度最高且牙槽骨吸收最少。
如果将病原菌抗原克隆到植物中培养出转基因的植物疫苗，则可以在进食消化植物时即获得接种疫苗的作用。
Shin等将霍乱毒素（cholera toxin，CT）B亚单位（CTB）—fimA互补DNA（complementary DNA，cDNA）转移到马铃薯细胞中，结果在马铃薯叶片基因组DNA中检测到CTB—fimA cDNA片段。
他们随后用这种马铃薯块茎喂养小鼠发现，小鼠血清及唾液中的抗体滴度明显升高，且能抵抗感染。
此试验构建出携带免疫显性抗原的转基因植物，证明在可食性植物中合成Fim发展牙周炎黏膜疫苗是可行的。
另外，李昂等成功构建了牙龈卟啉单胞菌fimA基因的原核表达载体pETl5b—fimA，并在结肠埃希菌中获得成功表达和纯化，为研制开发预防牙周炎的亚单位蛋白疫苗奠定了试验基础。
这些研究表明，Fim可以作为牙周炎疫苗的有效免疫原，诱导机体产生保护性免疫应答。
1.2牙龈蛋白 牙龈蛋白是牙龈卟啉单胞菌产生的胞外蛋白酶，是重要的致病因子之一，包括精氨酸一牙龈蛋白酶（arginine—gingipain，RGP）和赖氨酸一牙龈蛋白酶（1ysine—gingipain，KGP）。
RGP由rgpA和rgpB基因编码，RGPA和KGP结构相似，由前肽区、催化区和凝集区组成，RGPB则无凝集区。
凝集区在黏附红细胞中起重要作用。
若rgpA或rgpB基因突变，则会影响牙龈卟啉单胞菌的生长及其黏附于上皮细胞。
以热灭活牙龈卟啉单胞菌以及纯化的RGPA和RGPB分别于皮下免疫小鼠，皆产生特异性IgG，但只有RGPA组免于牙龈卟啉单胞菌引起的骨吸收。
因为在结构上，RGPA及RGPB有相似的前肽区和催化区，只有RGPB无凝集区，牙龈卟啉单胞菌特异性IgG及免疫保护的产生可能主要由RGPA的凝集区介导；所以，RGPA是优于RGPB的疫苗候选抗原。
Nakayama等用一种表达RGPA的DNA疫苗免疫小鼠后产生了特异性IgG。
随后的研究也证实，用这种疫苗免疫小鼠会产生特异性血清IgG和sIgA，且小鼠的血清可降低RGPA和RGPB蛋白的水解活性。
这些研究表明，RGPA—DNA疫苗可同时诱导体液及细胞免疫应答，为RGPA作为疫苗候选抗原提供了证据。
KGP是一种纤维蛋白降解酶，可介导牙龈卟啉单胞菌黏附牙周组织，侵入上皮细胞及结缔组织，具有较好的免疫原性，可诱导机体产生保护性免疫应答。
KGP催化区在牙龈卟啉单胞菌摄取氯高铁血红蛋白中起重要作用，去除KGP催化区基因的牙龈卟啉单胞菌产生没有色素沉着的突变体，在血平板上形成白色菌落（缺乏氯高铁血红蛋白）。
张凤秋等构建KGP催化区的真核重组表达质粒VR1020—KGP及pcDNA3.1—KGP催化区，以此作为基因疫苗免疫SD大鼠发现，唾液中的抗KGP催化区sIgA水平明显高于空载体对照组，且试验组牙槽骨破坏程度明显低于对照组。
Kuboniwa等用KGP催化区及RGP催化区DNA片段构成蛋白序列（protein sequence，pseq）2AKGP催化区和pSeq2B—RGP催化区质粒，用这两种质粒免疫小鼠，随后所有小鼠腹膜内注射牙龈卟啉单胞菌，结果没有免疫接种的小鼠72 h内全部死亡，而接种了质粒的小鼠则可以抑制炎症反应，延长存活率。
Persson发现，RGP和KGP参与牙龈卟啉单胞菌至少85%的蛋白水解活性和100%的胰酶样活性，在牙周组织的破坏中起重要作用。
Rajapakse等用RGPA—KGP复合物免疫小鼠，可以产生高滴度的血清IgG，减少骨吸收，阻止牙龈卟啉单胞菌感染。
有人分别采集25名牙周炎患者及牙周健康者的血清发现，两组血清都与RGPA—KGP复合物产生特异性IgG免疫应答，但患病组血清IgG明显高于健康组，且与显示疾病严重性的探诊深度及牙龈卟啉单胞菌阳性位点百分率密切相关。
即RGPA—KGP复合物免疫可抑制牙龈卟啉单胞菌定植及其引起的骨吸收，RGPA—KGP抗原产生了更强的免疫应答。
牙龈蛋白是牙龈卟啉单胞菌蛋白水解活性的主要成分，缺乏rgp和kgp基因会提高溶血活性，溶血反应是牙龈卟啉单胞菌获取血红蛋白中铁的主要途径，牙龈卟啉单胞菌需要亚铁血红蛋白来促进其生长及发酵氨基酸获取能量；因此牙龈蛋白是牙龈卟啉单胞菌生长及水解宿主的重要因子，亦可能是牙周炎疫苗的最佳候选抗原。
1.3血凝蛋白 HA是牙龈卟啉单胞菌的细菌表面蛋白，能介导细菌吸附、定植以及入侵宿主细胞，同时凝集和裂解红细胞来摄取细菌生长必需的亚铁血红蛋白。
HA包含多种亚型，主要有血凝蛋白A（HA）和血凝蛋白B（HA），其中HA，被广泛用于牙周炎疫苗的研究。
纯化的重组HA（recombinant HA，rHA，）可被牙周炎患者的血清识别，用rHA，接种小鼠可产生血清特异性HA，抗体。
2012年，Yuzawa用HA，与麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein，MBP）形成的复合物HA—MBP免疫小鼠，产生了高滴度的IgG、IgA和sIgA，且在唾液中检测到大量的抗原特异性IgA抗体形成细胞。
HA为血红蛋白高亲合受体，HA特异性抗体能阻断HA与血红蛋白的结合，阻止牙龈卟啉单胞菌黏附于人冠状动脉内皮细胞。
DeCarlo等分别用rHA、rHA+磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer solution，PBS）、PBS，rHA+弗氏佐剂（Freund adjuvant，FA）、FA接种小鼠，结果rHA+PBS和rHA+FA组均产生免疫应答，骨吸收被抑制。
另外，DeCarlo等在测量22名慢性牙周炎患者首次接诊及其中15名患者牙周基础治疗后1周和22周血清中的HA，抗体水平后发现，首诊时HA，抗体水平很低，治疗后部分患者抗体水平增高，且这种增高与牙周恢复情况呈正相关关系。
Nguyen等也证实，牙周治疗后部分患者的HA血清抗体滴度明显增高。
牙龈卟啉单胞菌Fim主要通过Toll样受体（Toll—like receptor，TLR）2途径诱导免疫应答，而HA则通过TLR4途转导信号。
因为牙龈卟啉单胞菌全细胞主要通过TLR2途径诱导免疫应答，因此Fim是牙龈卟啉单胞菌的免疫显性抗原，而HA却不是，但HA介导血凝反应及产生保护性细胞因子的能力使其可能成为疫苗候选抗原。
1.4外膜蛋白 牙龈卟啉单胞菌外膜50%以上由蛋白质组成，OMP是其主要成分。
OMP可影响牙龈卟啉单胞菌的定植和生长，具有多种抗原表位，可诱发机体免疫应答。
在众多牙龈卟啉单胞菌OMP中，与免疫相关的主要是OmpA样蛋白PG32和33以及相对分子质量为4.0×10的氯高铁血红蛋白（OMP）。
Ross等在小鼠皮下注射结肠埃希菌表达的重组PG32—PG33后发现，小鼠局部病损减轻。
有人以OMP40K和OMP40K+霍乱毒素A亚单位（CTA）突变体（mutant choleratoxin A subunit，mCTA）免疫小鼠，所产生的OMP特异性抗体可阻止牙龈卟啉单胞菌感染并降低骨吸收。
OMP具有较好的免疫原性，可诱导机体产生保护性免疫应答，且其序列结构具有高度的保守性。
1.5被膜蛋白 牙龈卟啉单胞菌被膜以荚膜多糖（capsularpolysaccharide，CPS）—K抗原为代表，CPS可保持牙龈卟啉单胞菌在宿主环境中的结构完整性。
有CPS型的牙龈卟啉单胞菌菌株毒力更强，在动物试验中引起侵入性的扩散的结缔组织炎，而无CPS型的菌株引起非侵入性的局限性脓肿。
用牙龈卟啉单胞菌CPS接种的小鼠可产生高滴度的IgG和IgM，从而阻止牙槽骨吸收，且这些特异性抗体可以保护机体免于多种病原菌的感染。
Califano等发现在慢性牙周炎及侵袭性牙周炎患者的血清中，皆有CPS特异性IgG。
1.6热休克蛋白 HSP可作为蛋白质组装的伴随分子及降解毒性蛋白的蛋白酶，种类繁多，其中HSP60是多种细菌感染性疾病的主要抗原，具有很强的免疫原性，参与包括慢性牙周炎在内的多种慢性疾病的发展。