雄黄抑制宫颈癌细胞株增殖和诱导凋亡的体外研究

作者：尹伶 濮德敏 吴青 郭孝鹏。

【摘要】 　　目的： 体外研究中药雄黄主要成分As4S4对子宫颈癌细胞株Hela细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用。方法：以As4S4不同浓度 (7.5、15、30、60mg/L)，分12h,24h,36h,48h,60h处理Hela细胞,用光镜观察细胞变化；四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制率；流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率；用DNA梯状电泳(DNA ladder)检测凋亡的发生。结果：不同浓度 (7.5、15、30、60 mg/L )的As4S4处理的Hela细胞,细胞增殖受到抑制，作用呈明显的时效和量效关系，差异有非常显著性(P0.01)；As4S4诱导Hela 细胞的凋亡率为(8.13±1.13)%～(62.36 ±4.42)%,与对照组比较(2.84±1.88)%,差异有极显著性(P0.01),并呈浓度依赖性；DNA ladder呈梯状条带。结论： 雄黄体外对宫颈癌细胞株Hela细胞具有增殖抑制和促进凋亡作用。

【关键词】 As4S4； 增殖抑制; Hela细胞; 凋亡。

祖国的传统中药雄黄是砷剂的一种，主要成分为硫化砷(As4S4)，在我国传统医学中有悠久的应用历史。近来中药砷剂(雄黄、砒霜)在治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)方面取得了明显的疗效［1～3］，发现中药砷剂具有抗肿瘤作用，其主要机制是诱导肿瘤细胞凋亡。目前对氧化砷（砒霜）的研究较为广泛,而对硫化砷雄黄研究的报道较少，对妇科肿瘤的作用未见报道。 　　子宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤,由于近年来性传播疾病的蔓延,宫颈癌的发病率又有上升和年轻化趋势。目前治疗宫颈癌以手术为主, 但根治术的5年生存率较低,子宫颈癌对放疗的敏感性具有个体差异,且放疗后易出现局部转移和复发, 因此寻找有效的子宫颈癌化疗药物具有重要意义。本研究对雄黄的主要成分硫化砷对人子宫颈癌Hela细胞体外作用进行了探讨,旨在为寻找新的有效治疗子宫颈癌的药物提供理论依据。

1 材料和方法。

1.1 材料 　　人宫颈癌Hela细胞株购自上海科学院生物细胞研究所。高纯度雄黄As4S4（95%）由西安交通大学血液病研究中心提纯惠赠。5%四甲基偶氮唑蓝(MTT 溶液,上海华美生物工程公司);苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制剂、DNA Ladder试剂盒(美国Sigma公司);胰蛋白酶、RMPI 1640 培养基、小牛血清(武汉凌飞生物公司)。

1.2 细胞形态观察 　　每瓶(25cm2) 接种1.5×105细胞,24ｈ后加入不同浓度(7.5、15、30、60mg/L)的As4S4处理,每天用倒置显微镜观察记录实验组和对照组的细胞形态变化。

1.3 MTT 检测 　　以每孔1×105 个Hela细胞接种于96孔培养板, 分为空白组(调零)、As4S4实验组(7.5、15、30、60 mg/L mg/L)和对照组(不加药物的细胞)，分别培养12h,24h,36h,48h,60h后加入MTT液，再培养4h，吸弃孔中的培养上清,每孔加入150μl DMSO, 混匀10min ,在酶联免疫检测分析仪570nm处测定各孔吸光度值(A), 抑制率(%)=(1— 实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。重复3次取平均值。

1.4 DNA梯状电泳(DNA ladder) 　　培养细胞离心换液后,经冷PBS洗2遍,按照试剂盒说明提取DNA,并溶于无DNA酶的TE液中,20V电泳4h琼脂糖凝胶电泳后,KODAK DNA analysis 2.0 凝胶成像系统分析。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 　　用AnnexinVFITC及PI双标流式细胞仪检测细胞凋亡,分为实验组和阴性对照组。实验组分别加入终浓度为7.5、15、30、60 mg/L 的As4S4作用24h，未加药组为对照组，用70%乙醇4℃固定24h，PBS缓冲液洗去固定液，离心去上清。用缓冲液37℃孵育60 min，195μl细胞悬液加5μl AnnexinVFITC，混匀，室温10min。用缓冲液洗涤细胞1次，在190μl缓冲液中重悬，然后再加10μl(含20μg)碘化丙啶，上流式细胞仪检测。

1.6 统计分析 　　采用SPSS11.5统计软件包进行t检验分析，ANOVA 分析。

2 结果。

2.1 光镜下Hela细胞凋亡的形态学变化 　　正常生长的Hela细胞为上皮样细胞，粘附生长于培养瓶壁上，细胞平坦。 　　As4S4处理Hela细胞24h, 7.5 mg/L处理组可见细胞间有间隙，细胞形态变化不明显；15 mg/L处理组可见细胞变圆,体积缩小；30 mg/L处理组可见细胞间距离增大，圆细胞增多，细胞皱缩，核固缩出现,核颜色加深,折光性增强；60mg/L处理组可见细胞脱落悬浮在培养基中。随着As4S4作用时间增加，以上变化更明显，至60h，细胞坏死。对照组细胞贴壁生长,几乎无脱落,胞质饱满,生长舒展,相邻细胞生长融合成片。