铁皮石斛茎节离体培养的研究
【摘要】 目的通过无菌茎段实现铁皮石斛快速繁殖。方法将铁皮石斛试管苗茎节接种于不同NAA浓度的MS培养基上诱导腋芽萌发，并在含不同激素配比和有机添加物的培养基上继代和诱导生根。结果NAA 0.4 mg/L，6—BA 5 mg/L时铁皮石斛腋芽萌发率达93.33%；NAA 0.3 mg/L，6—BA 2 mg/L时丛苗的生根率达96.67%，香蕉汁和土豆汁能够显著促进丛生芽的增殖和壮苗生根。结论建立了适合铁皮石斛茎段离体培养的快速繁殖体系。
【关键词】 铁皮石斛 无菌茎节 离体培养 激素浓度 有机添加物。
Abstract:ObjectiveTo develop a rapid propagation of Dendrobium candidum using the aseptic nodal segments of shoots.MethodsAxenic nodal segments were first germinated on Murashige and Skoog(MS)basal medium supplemented with different concentration NAA.The seedlings were subcultured and rooted on the medium containing different concentration hormones and organic susbstance.Results93.33% of the axenic nodal segments of Dendrobium candidum germinated on the medium with NAA 0.4 mg/L,6—BA 5 mg/L and 96.67% of explant rooted on the medium containing NAA 0.3 mg/L,6—BA 2 mg/L.The growth of explant was promoted by the extract of banana and potato.ConclusionThe in vitro propagation of Dendrobium candidum from axenic nodal segment has been established.
Key words:Dendrobium candidum； Axenic nodal segments； In vitro propagation； Concentration of hormone； Organic susbstance。
石斛最早见于《山海经》，药用始载于《神农本草经》，其后，历代诸家本草均予录述。在《本草纲目》中被列为上品。至今石斛仍是中医常用的滋阴清肺、生津止渴、养胃除烦之要药，其应用范围更有扩大之势。近年研究发现石斛中含有石斛多糖［1］、生物碱［2～4］、鼓槌菲和毛兰素［5］等化合物，以及7种人体必需氨基酸［6］和多种微量元素。现代药理表明石斛具有抗肿瘤［7］、抗衰老、增强免疫力［8］等功能，对心血管、消化系统、呼吸系统和眼科疾病均有明显的治疗作用［9］。
铁皮石斛Dendrobium candidum是现行版《中国药典》收载的5种常用石斛之一，是石斛类药材的上品。铁皮石斛又名黑节草、铁皮吊兰、铁皮兰，属兰科石斛属附生植物。加工后的铁皮石斛又被称为铁皮枫斗，市场价格昂贵，是一种经济价值和医用价值都很高的名贵中药。然而由于近年来过度采伐、生态环境破坏等原因，铁皮石斛野生资源日渐匮竭，而其对生境要求苛刻、自然繁殖率低等因素进一步将铁皮石斛推向灭绝的边缘，现在已被列为濒危保护的中药品种［10］。利用铁皮石斛体外快繁是解决目前铁皮石斛资源与需求矛盾的重要途径。目前关于铁皮石斛的研究主要集中在原球茎增殖、分化等方面［11,12］，以茎节为材料，实现铁皮石斛体外快繁的研究尚鲜见报道。本研究拟通过无菌茎段的离体培养，建立适合铁皮石斛的快速繁殖体系。
1 材料与方法。
1.1 材料。
选择与处理以本实验室培养保存的生长旺盛、茎节粗壮的铁皮石斛试管苗为材料，切成长度为1～1.5 cm带1～2个腋芽的小茎段。
1.2 腋芽萌发将无菌茎段接种于添加30 g·L—1蔗糖、8.0 g·L—1琼脂、pH为5.6的MS培养基上。其中6—BA 5 mg·L—1，并加入不同浓度的NAA（0～0.8 mg·L—1）。培养温度为25 ℃，光照强度为2 000 lux，光照时间为12 h·d—1。定期观察不同浓度生长素对铁皮石斛腋芽萌发的作用。
1.3 丛生芽增殖将已萌发的腋芽接种于MS+30 g·L—1 蔗糖+NAA 0.4 mg·L—1+6—BA 5 mg·L—1，并添加200 g·L—1的香蕉、土豆、西瓜、豆芽的增殖培养基上，并以不加天然添加物的培养基为对照，pH均为5.6，考察不同提取物对丛生芽增殖的影响。培养条件同上。
1.4 壮苗生根将生长健壮，株高为2 cm左右的丛生苗接种于MS+30 g·L—1蔗糖+8.0 g·L—1琼脂，激素浓度分别为NAA 0.1，0.3，0.5 mg·L—1和6—BA 2，4 mg·L—1或MS+30 g·L—1蔗糖+NAA 0.3 mg·L—1+6—BA 2 mg·L—1 +8.0 g·L—1 琼脂，添加200 g·L—1不同提取物的生根培养基上，进行诱导生根和壮苗试验。培养条件同上。
1.5 统计试管苗生长状况试管苗接种培养50 d后，分别观察统计芽诱导率、芽增殖数、株高、根诱导率、生根数、根长、植株健壮度及褐化程度。
2 结果。
2.1 不同生长素浓度对茎段腋芽的诱导作用在6—BA 为5 mg·L—1时，不同浓度的NAA诱导茎段腋芽萌发的结果如表1所示。由表1可知NAA对铁皮石斛茎段腋芽萌发的作用与其浓度有关。当加入浓度较低时，NAA能够显著促进腋芽萌发，NAA 浓度为0.4 mg·L—1时，腋芽萌发率、增殖倍数达到最高，分别为93.33%和1.97，而且叶色黑绿，茎粗壮，形成大量丛生芽。而NAA浓度继续升高时，腋芽萌发率及增殖倍数均明显下降，而且由于部分材料坏死，导致实验中的总芽数减少。实验中还发现当NAA浓度过高时，部分腋芽萌发后，发生畸变，分化为花芽，并逐渐枯萎死去。结果表明低浓度的NAA 可以促进铁皮石斛腋芽萌发，诱导芽的分化，植株生长健壮。但NAA的浓度过高时，则会抑制腋芽的萌发和植株生长，并促进花芽形成，更适于观赏石斛的培养。根据实验结果，以NAA 0.4，6—BA 5 mg·L—1为继代培养基，对试管苗进行继代培养，结果生长良好、植株健壮、增殖倍数高（达到3.2倍）。表1 NAA对铁皮石斛腋芽萌发的影响（略）。