丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠脑内GCSF和TNFα表达的影响

作者：王书霞 滕军放 康康 曾芳。

【摘要】 目的 研究丁基苯酞对慢性脑缺血大鼠脑内GCSF和TNFα表达的影响。方法 采用双侧颈总动脉永久性结扎(2VO)制备慢性脑缺血模型，治疗组大鼠给予丁基苯酞灌胃，免疫组织化学法多克隆抗体GCSF和TNFα标记大鼠脑内梗死区神经元、血管内皮、胶质细胞。持久性2VO 2个月。结果 治疗组大鼠脑内GCSF明显增多,TNFα明显减少。结论 丁基苯酞能增加2VO大鼠脑内GCSF的表达并能减少TNFα的表达，促进慢性脑缺血的代偿修复。

【关键词】 丁基苯酞；慢性脑缺血；GCSF；TNFα。

慢性脑缺血是指各种原因导致的长期脑灌流不足,促使脑组织发生一系列病理及生化改变的慢性疾病,是血管性痴呆(VD)、Binswanger病、Alzheimer病(AD)等多种疾病发展过程中的共同病理过程。其治疗关键在于尽快恢复缺血区的血供,挽救濒死的神经元、神经胶质和血管内皮细胞，促进脑功能恢复。粒细胞集落刺激因子(GCSF)是造血生长因子家族中的一个成员，GCSF可诱导内皮细胞的迁移和增殖，增加脑卒中后的新生血管〔1〕，并具有神经保护和抗炎特性〔2，3〕。肿瘤坏死因子α（TNFα）是炎症反应的关键调节因子之一，可从多种不同的炎症细胞中释放，对局部炎症、免疫应答等起重要调节作用。dl3一正丁基苯酞(NBP)是人工合成的消旋体，动物实验研究证明，NBP具有增加脑缺血区血流量和改善缺血区微循环，缩小局灶性脑缺血后的梗死灶，保护线粒体的功能等〔4〕。有关NBP的研究多集中于急、慢性脑缺血中研究较少。本研究旨在采用免疫组化方法观察大鼠在对慢性脑缺血适应过程中GCSF和TNFα的表达变化，并探讨NBP对其表达的影响和对大鼠实验性慢性脑缺血的保护作用。

1 材料与方法。

1.1 实验试剂 GCSF抗体，购于博士德公司，TNFα抗体，购于北京博奥森公司，SP试剂盒为北京中山公司提供,丁基苯酞（NBP）批准文号：050106，纯度为97.01％，用Tween80(0.5％)制成乳剂。

1.2 实验动物与分组 实验动物由郑州大学医学院动物中心提供的健康Wistar大鼠80只，12～14月龄，体重450～550 g。随机分为对照组（假手术+溶剂）；单纯缺血组（手术+溶剂）；缺血低剂量治疗组（手术+低剂量NBP+溶剂）；缺血高剂量治疗组（手术+高剂量NBP+溶剂）；每组20只。

1.3 方法。

1.3.1 动物模型制作 10％水和氯醛(2 mg／kg)腹腔内注射麻醉，钝性分离双侧颈总动脉，每侧用0号手术线分别结扎颈总动脉的远心端与近心端，从中间剪断，缝合皮肤。假手术组只分离双侧颈总动脉，既不结扎也不剪断。

1.3.2 给药方法 低剂量治疗组和高剂量治疗组于造模2个月后分别按60、120 mg/kg给予NBP每日灌喂，NBP用花生油稀释至2 ml。对照组和单纯缺血组于造模2个月后每日给予花生油2 ml灌喂，各组皆连续灌喂1个月。

1.3.3 标本制作 分别取实验组及对照组大鼠，10％水合氯醛麻醉，250 ml生理盐水(37℃)经心脏灌注快速冲洗血细胞，用4％多聚甲醛(4℃)250 ml灌注。直到大鼠全身僵硬为止，快速开颅，取出全脑，去除脑干和小脑，4％多聚甲醛固定24～48 h，石蜡包埋后3 μm厚连续切片。

1.3.4 阳性细胞的辨认和计数 免疫组化阳性细胞显色为棕黄色，GCSF为神经元细胞、内皮细胞胞浆及胶质细胞胞核着色，TNFα为神经元细胞胞浆着色，计数方法：对每张玻片随机取5个高倍镜视野，计数5个高倍视野内的阳性细胞总数，取平均值作为计数结果。

1.4 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS12.0行多组间单因素方差分析LSD法行两两比较。

2 结 果。

2.1 NBP对大鼠皮层和海马结构中GCSF表达的影响 GCSF表达主要见于皮质和海马的神经元、血管内皮细胞胞浆和神经胶质细胞胞核，阳性表现为棕黄色或褐黄色着色。对照组皮层和海马的GCSF呈少量表达，单纯缺血组皮层和海马的GCSF表达与对照组差别无统计学意义（P＞0.05），低剂量治疗组和高剂量治疗组皮层和海马的GCSF表达明显多于单纯缺血组（P＜0.05），且高剂量治疗组皮层和海马的GCSF表达明显多于低剂量治疗组（P＜0.05），见表1。

2.2 NBP对大鼠皮质和海马中TNFα表达的影响 TNFα表达主要见于皮质和海马的神经元细胞胞浆，胞浆呈棕黄色。对照组皮层和海马的TNFα呈少量表达，单纯缺血组皮层和海马的TNFα表达明显多于对照组（P＜0.05），低剂量治疗组和高剂量治疗组皮层和海马的TNFα表达明显少于单纯缺血组（P＜0.05），且高剂量治疗组皮层和海马的TNFα表达明显少于低剂量治疗组（P＜0.05），见表2。表1 各组大鼠不同脑区GCSF阳性细胞数的比较与单纯缺血组比较：1）P＜0.05；与低剂量治疗组比较：2）P＜0.05，下表同表2 各组大鼠不同脑区TNFα阳性细胞数的比较。