通冠胶囊对颈动脉球囊损伤后大鼠血清基质细胞衍生因子1和血管

作者：訾勇，张敏州，王磊，郭力恒，张军，温春瑜，杨澄。

【摘要】 【目的】观察通冠胶囊对颈动脉球囊损伤模型大鼠基质细胞衍生因子1(SDF1)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。【方法】复制大鼠左颈总动脉球囊损伤模型，将54只造模成功的SD大鼠随机分为通冠胶囊组(剂量为600 mg·kg—1·d—1)、模型组和辛伐他汀组(剂量为2 mg·kg—1·d—1);于术后第4、8、12周处死动物，采用苏木素—伊红(HE)染色及弹力纤维染色法观察血管壁增生情况，采用计算机图像分析内、中膜面积比值(Ai/Am)观察通冠胶囊对新生内膜形成的影响，采用酶联免疫吸附法检测SDF1、VEGF水平。【结果】通冠胶囊组、辛伐他汀组与模型组比较，VEGF 、SDF1水平在颈动脉球囊损伤后不同时段大鼠的血清中表达显著增高(均P001)，8周时通冠胶囊组SDF1表达较辛伐他汀组显著升高(P005)，12周通冠胶囊组VEGF表达与辛伐他汀组比较，差异有显著性意义(P005)。球囊损伤后4周内膜增生明显，8周形成的增生内膜有少量减少，12周时形成的新生内膜减少明显。通冠胶囊可使损伤后4、8、12周形成的新生内膜较模型组显著减少，Ai/Am较模型组显著降低(均P001)。【结论】通冠胶囊可以促进大鼠颈总动脉球囊损伤后血清中SDF1及VEGF的表达，并减少新生内膜的形成。

【关键词】 通冠胶囊/药理学;冠状动脉疾病/中药疗法;血管内膜/病理学;疾病模型，动物;大鼠。

目前普遍认为血管内膜增生在粥样斑块以及血管成形术后再狭窄的形成过程中都起到了关键性的作用。内皮细胞结构和功能损伤是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)、冠心病介入治疗后再狭窄(restenosis，RS)共有的始动病理机制[1—2]。血管内皮生长因子(VEGF)是内皮细胞唯一的特异性促有丝分裂原,具有促进内皮细胞增殖、增加微血管通透性、诱导血管生成等多种功能[3]。基质细胞衍生因子1(SDF1)与其特异性受体细胞因子受体4(CXCR4)相互作用，构成SDF1/CXCR4反应轴，对抑制动脉粥样硬化的发生发展起着重要的作用。VEGF 和SDF1在动脉粥样硬化及冠心病介入治疗后再狭窄过程中的作用正越来越受到重视。本研究采用颈动脉球囊损伤大鼠模型观察通冠胶囊对SDF1、VEGF表达的影响，探讨通冠胶囊保护血管内皮、防治冠心病介入治疗后再狭窄及促进血管新生的作用机制。现报道如下。

1材料与方法。

11主要试剂、仪器及药物VEGF 和SDF1酶联免疫检测试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司(一抗)、上海西唐科技有限公司(二抗);Powerwave HT型酶标仪(美国Biotek公司);CHA213W型显微镜(日本OLYMPUS公司);Image ProPlus 60图像分析系统;JD801型数码医学显微图像分析系统(江苏省捷达科技发展有限公司)、通冠胶囊由广东省中医院制剂科提供(生产批号：07110504);舒降之片由默沙东制药有限公司提供(辛伐他汀，生产批号：08023)。

12模型复制及实验分组采用内膜剥脱法制备大鼠颈动脉狭窄模型[4]。用100 mg/L水合氯醛溶液，按400 mg/kg 腹腔麻醉大鼠，取仰卧位固定，常规消毒大鼠颈前皮肤,取颈部正中切口，从颈外静脉注射肝素钠100 U/kg，寻找到左颈总动脉和颈外、颈内动脉分叉处，在左颈总动脉近心端暂时阻断血流，靠近分叉处用血管分离棒轻轻分离颈外动脉，其近心端和远心端各穿一4号丝线待用。从颈外动脉处将15 F Forgaty导管插入至颈总动脉约15 cm，在直视下观察球囊的插入深度，肝素生理盐水充盈球囊，缓慢回抽球囊至动脉分叉处，反复3次剥脱内膜。将导管撤出后，结扎颈外动脉近段，去除血管夹，恢复血流，查看颈总动脉和颈内动脉搏动是否良好。缝合伤口，送回动物观察室，腹腔注射青霉素预防感染。

选取雄性SD大鼠54只，SPF级，体质量180～220 g，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证编号：SCXK(粤)20030001。造模后将大鼠随机分为3组各18只：辛伐他汀组(剂量为2 mg·kg—1·d—1)、通冠胶囊组(600 mg·kg—1·d—1)、模型组(给予10 mL·kg—1·d—1生理盐水)，各组分别于术后第4、8、12周取材，每个时间段每组各6只。

13样品采集及处理用100 mg/L水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠，取出损伤部位的左颈总动脉约2 cm长，磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗后置入40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋病理切片，每个标本均匀间断切片8张，切片厚度3 μm。切片行苏木素—伊红(HE)染色及弹力纤维染色。在光镜下观察血管内膜增生情况，以内弹力板和外弹力板为标准区分内膜、中膜和外膜。SDF1、VEGF酶联免疫吸附检测具体操作方法及评判标准参照试剂盒说明书进行。

14图像分析及统计学处理在普通光镜下固定各种光学参数，对标本进行扫描，以TIFF格式存入电脑;用Image Pro Plus 60软件进行图像分析。通过血管HE染色及弹力纤维染色计算：内膜面积、中膜面积、内膜和中膜面积比值(intima area/media area，Ai/Am)。①在40倍视野偏振光光镜下，固定显微镜的各项光学常数，对损伤血管进行扫描，图像以TIFF格式存入电脑;②在Image Pro Plus 60环境下打开一幅图像，利用软件中的Count and Size功能自动计算出Ai/Am。采用数码医学显微图像分析系统在400倍放大倍数下,连续扫描5个视野,读取平均光密度值作为VEGF的相对表达量。

15统计学方法采用SPSS 115统计软件包进行数据处理，组间差异性比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验法。

2结果。

21组织学观察正常大鼠颈动脉内膜为单层内皮细胞，中膜由4～5层环行排列呈波浪状的弹性膜和平滑肌细胞组成，外膜由结缔组织组成。球囊损伤后，可见动脉内皮剥脱，个别处内弹力板破裂，内弹力板由正常时的波浪状变平坦，失去弹性。球囊损伤后4周内膜增生明显，8周形成的增生内膜有少量减少，12周时形成的新生内膜减少明显。模型组球囊损伤后4周内膜增生达到高峰。通冠胶囊组损伤后4、8、12周Ai/Am较模型组显著降低(均P001);与4周、8周同时段辛伐他汀组Ai/Am值比较差异无显著性意义(P005)，与12周辛伐他汀组Ai/Am值比较，差异有显著性意义(P005);辛伐他汀组的变化趋势与通冠胶囊组相似，与同时段模型组比较差异有显著性意义(均P001)。结果见表1、图1、图2。表1各组大鼠损伤颈动脉不同时段Ai/Am的比。

22各组大鼠血清VEGF水平比较表2结果显示，通冠胶囊组、辛伐他汀组术后4、8、12周VEGF水平与模型组比较，差异均有显著性意义(P001)。4、8周VEGF水平通冠胶囊组与辛伐他汀组比较差异无显著性意义(P005)。12周VEGF水平通冠胶囊组较辛伐他汀组显著增高(P005)。

23各组大鼠血清SDF1水平比较通冠胶囊组、辛伐他汀组术后4、8、12周SDF1水平与模型组比较差异均有显著性意义(P001)。术后4、12周SDF1水平通冠胶囊组与辛伐他汀组比较差异无显著性意义(P005);术后8周SDF1水平通冠胶囊组与辛伐他汀组比较差异有显著性意义(P005)。