小建中汤有无饴糖对实验性脾虚证小鼠血管活性肠肽的影响
【摘要】 目的研究小建中汤有无饴糖对实验性脾虚证小鼠血管活性肠肽的影响。方法以脾虚证小鼠为实验对象，运用放免法测定血浆血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)含量，免疫组化法分析空肠VIP的表达。结果小建中汤有无饴糖均能显著降低血浆中VIP含量，减少空肠VIP表达。结论小建中汤有无饴糖均能显著降低VIP，为小建中汤配伍规律研究提供实验基础。
脾虚证本质的现代研究至今已有二十多年的历史，其中胃肠激素与胃肠运动关系的研究一直是中西医结合研究消化系统及脾虚症、脾主运化本质的一个热点［1］。VIP是肠神经系统中具有代表性的神经肽［2］，由胃肠道粘膜上的D1细胞所分泌，对胃肠运动有重要的调节作用［3］。本实验以苦寒泻下药番泻叶复制脾虚证的实验动物模型为研究对象，观察小建中汤方中有无饴糖对实验性小鼠脾虚证的胃肠动力及血管活性肠肽的影响，为小建中汤的临床应用及配伍规律研究提供药理学实验基础。
1 材料。
1.1 药物制备小建中汤：由饴糖、桂枝、芍药、甘草、生姜、大枣6味中药组成。以上中药均购自贵阳市阜康堂药店（除饴糖外）。除饴糖外，其余5味先用常水浸泡30 min后加水煎煮2次，每次以武火煮沸15 min，再以文火煎煮30 min；煎液过滤，合并滤液；取1/2滤液按处方量加入饴糖，另1/2滤液不加饴糖，将两滤液于60℃水浴减压浓缩成100%浓度(1 g生药/ml)的药液，即得实验用原方小建中汤(XJZT)、无糖小建中汤 (XJZTW)，4℃保存备用。处方中药物比例严格按照张仲景《伤寒论》与统编教材方剂学的药物剂量与比例要求［4］。番泻叶水浸剂：番泻叶购自贵阳市阜康堂药店。将番泻叶投入沸水浸泡［5］，自然冷却后过滤，收集滤液于60℃水浴减压浓缩成100%浓度(1 g生药/ml)的药液，4℃保存备用。所有药材经贵阳医学院生药学与药用植物学教研室龙庆德老师鉴定，均符合《中国药典》2005版要求。
补中益气丸(Buzhong Yiqi Pill，BYP)， 襄樊隆中药业有限公司，批号：050102。实验时用蒸馏水配成所需浓度。
1.2 动物清洁级KM小鼠，雌雄兼用，（20±2）g，由贵阳医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(黔)2002—0001。
1.3 试剂兔抗血管活性肠肽抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，即用型SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，VIP放射免疫测定试剂盒(尚柏生物医学技术有限公司)，Biomias99图象分析系统(四川大学图像图形研究所)。
2 方法。
2.1 实验性小鼠脾虚证模型的复制、分组及给药［6］取清洁级KM小鼠70只，雌雄各半，体质量（20±2）g，按体质量随机分为7组（每组10只）：正常对照组（等容积蒸馏水）、模型组(等容积蒸馏水)、BYP组（2 g/kg）、XJZT高剂量组（48 g/kg）、XJZT低剂量组（12 g/kg）、XJZTW高剂量组（28 g/kg）、XJZTW低剂量组（7g/kg）。除对照组ig给予等容积蒸馏水外，其余组动物均ig给予番泻叶水浸剂 0.5 ml/只，1次/d，连续7 d以复制脾虚证模型。实验第8天，动物均ig 给予相应药物，1次/d，连续7 d。其间密切观察小鼠的外观体征（精神活动状况、皮毛色泽等）及饮食、饮水、大小便，并每日称量体质量。
2.2 小建中汤有无饴糖对脾虚证小鼠血浆VIP含量的影响末次给药后，小鼠眼球取血0.2 ml，加10％EDTA—Na2 30 μl、抑肽酶40 μl混匀，2 000 r/min离心10 min，取上清液于—40℃保存，按试剂盒说明用放免法检测VIP含量。
2.3 小建中汤有无饴糖对脾虚证小鼠空肠VIP表达的影响末次给药小鼠脱颈椎处死后，取空肠组织，10%福尔马林固定，常规脱水，包埋，切片，采用即用型二步法VIP试剂盒，检测空肠组织VIP表达的变化。用Biomias99图像分析系统观察VIP免疫反应阳性产物的分布情况，并测量平均灰度(平均灰度值与切片阳性表达强弱成反比，即平均灰度值越小，切片阳性表达越强，表明VIP含量越多；反之，平均灰度值越大，切片阳性表达越弱，则VIP含量越少)。
2.4 数据分析与处理数据以±s表示，所有资料采用Student—t 检验处理。
3 结果。
3.1 小建中汤有无饴糖对脾虚证小鼠血浆VIP含量的影响番泻叶灌胃给予小鼠复制实验性脾虚证动物模型，小鼠血浆中VIP含量显著增加，连续灌胃给予XJZT和XJZTW 7 d，XJZT和ZJZTW均可以显著降低血浆中VIP的含量，而且XJZT与XJZTW高、低剂量组间未见显著性差异。结果见表1。表1 小建中汤有无饴糖对实验性脾虚证小鼠血浆VIP含量的影响（略）。
3.2 小建中汤有无饴糖对脾虚证小鼠空肠VIP表达的影响免疫组化染色显示，模型组VIP阳性产物呈棕黄色颗粒，主要分布在空肠粘膜腺上皮细胞的胞浆内；应用小建中汤加减饴糖方后，空肠粘膜腺上皮细胞胞浆内VIP阳性产物明显减少，表现在平均灰度值增加。XJZT高、低剂量组及XJZT 高、低剂量组均可显著降低实验性脾虚证小鼠空肠VIP蛋白的表达，与模型组比较，差异显著。XJZT高、低剂量组与XJZTW高、低剂量组比较，未见明显差异，提示小建中汤加减饴糖方对实验性脾虚证小鼠空肠VIP蛋白表达的影响无明显差异。结果见表2和图1。表2 小建中汤有无饴糖对实验性脾虚证小鼠空肠组织VIP蛋白表达的影响（略）。