TolC表达量与大肠埃希菌K—12耐四环素的研究
作者：张丹凤 黄传钟 王三英。
【摘要】 随着抗生素的开发与使用，细菌在对多种抗生素的适应过程中逐渐发展出对抗生素耐药的反应机制。TolC是药物排出转运体系的外膜成分，与AcrAB一起形成主要的药物排出泵，有关其表达量与耐药间的关系目前尚不清楚。试验将tolC克隆到pET—32a载体上进行诱导表达，镍柱纯化，免疫新西兰大白兔，获得1∶4000的抗血清。Western blotting分析表明，TolC的表达量在耐四环素的大肠埃希菌K—12中比对照组提高50%。细菌TolC高表达试验发现，其MIC从100μg/ml提高到200μg/ml。结果说明TolC的表达量与四环素耐药性直接相关，提示细菌可以通过调节外膜蛋白的表达实现对抗生素的耐受。
【关键词】 TolC； 耐药性； 大肠埃希菌K—12； 四环素。
ABSTRACT Association of TolC expression with resistance to tetracycline in Escherichia coli K—12 was studid. TolC was an outer membrane protein, which was bound with AcrAB to form a critical multidrug efflux pump. However, association of TolC amount with drug resistance was ill—defined. In the study, tolC was cloned into pET—32a vector induced expression and its recombinant proteins were purified by Ni—NTA. The purified recombinant proteins were used for preparing of anti—TolC. The prepared antiserum with titer 1∶4000 was utilized as the primary antibody in Western blotting. It showed that TolC amount was increased 50% in tetracycline—resistant E.coli K—12 compared to its original control strain. When TolC was overexpressed, the strain showed strong resistance to tetracycline with its MIC from 100μg/ml to 200μg/ml. These findings indicated that TolC amount was directly correlated to bacterial resistance to tetracycline, suggesting that bacteria mounted an adaptive feedback to antibiotics by regulating outer membrane protein expression.
KEY WORDS TolC; Drug resistance; E.coli K—12; Tetracycline。
随着人们对抗生素的过分依赖和滥用，耐药菌株迅猛发展，对人类健康构成严重的威胁。四环素通过与核糖体的30S亚单位结合以抑制细菌蛋白合成［1］而成为广谱抗生素，其抗菌谱包括许多革兰阳性和阴性菌、立克次体、支原体、衣原体、放线菌等。在20世纪50年代，细菌对四环素都非常敏感；1953年Flakow等［2］首次发现痢疾志贺菌S.dysenteriae对四环素产生耐药性。后来又发现志贺菌属Shigella对四环素、氯霉素和链霉素产生了多重耐药性［2～4］。目前认为，细菌耐四环素机制可以分成以下三类：①产生相应的水解及修饰酶以破坏药物活性；②改变药物靶点的结构，使药物无法识别；③阻止药物与靶点接触，其中包括调节膜通透性以及药物排出转运体系的作用，而这两者都与外膜蛋白的作用紧密相关［5］。药物排出转运体系是当前细菌耐药性研究关注的热点，如大肠埃希菌中的AcrAB—TolC系统［6］和铜绿假单胞菌中的MexAB—OprM系统［7］等。药物排出转运体系是对抗生素开发及应用的一个挑战，深入研究其机制将有助于我们发现新的抗菌机制、找到新的靶点。AcrAB—TolC排出系统是大肠埃希菌的主要多重药物外排系统，由内膜转运体AcrB、周质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC组成［6］。Xu等［8］报道，在耐四环素大肠埃希菌K—12中，TolC的表达量上调。Cristobal等［9］发现，大肠埃希菌tolC突变株对四环素的耐药性相对于对照大肠埃希菌下降了5～6倍；当AcrAB转运体系缺失，对四环素的耐药性与tolC突变株一样，MIC值均下降。这些研究表明，AcrAB—TolC排出系统在大肠埃希菌对四环素耐药性中的重要性，目前有关TolC表达量与耐药间的关系尚不清楚。鉴于从蛋白质水平更能直接反映有关生物学意义，本研究探讨TolC在模式菌大肠埃希菌K—12耐四环素中的作用和意义，旨在深入研究AcrAB—TolC药物排出转运系统的作用机制，促进新型抗菌药物的研发。
1 实验材料与方法。
1.1 菌株及质粒来源。
大肠埃希菌K—12购自中国科学院微生物研究所，大肠埃希菌工程菌株为大肠埃希菌DH5α和BL21(DE3)为本实验室保存菌株；质粒载体pET—32a为本实验室保存质粒。
1.2 tolC的克隆。
tolC的引物根据NCBI上大肠埃希菌K—12的基因组序列设计，并在引物的两端引入酶切位点，P1：5′—CGAGAATTCATGCAAATGAAGAAA—3′；P2：5′—GGTCTCGAGTCAGTTACGGAA—AGGG—3′。PCR扩增后，产物进行胶回收，回收产物与pET—32a质粒均用EcoRI与XhoI进行双酶切、回收、连接和转化，筛选含有目的基因的克隆子。
1.3 TolC的诱导表达与纯化。
将含有目的基因的克隆子转化大肠埃希菌BL21，对照菌和重组菌分别挑取单菌落接种于3ml含100μg/ml氨苄西林的LB培养基中，于37℃培养至A600约0.5。加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养3h，SDS—PAGE电泳检测。大量接种300ml菌液进行诱导表达，并根据Novagen公司Ni—NTA试剂盒说明书操作步骤进行纯化，洗脱样品于—20℃保存。
1.4 MALDI—TOF/MS鉴定。
按照Xu等［8］的方法进行样品处理，使用德国Bruker公司的ReFlexTM III MALDI—TOF质谱仪进行分析，反射模式，离子源加速电压1为20kv，加速电压2为23kv，N2激光波长337nm，脉冲宽度为3ns，离子延迟提取2000ns，真空度1.4×10—7Torr，质谱信号单次扫描累加50次，并用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，获得肽质量指纹图谱。
1.5 兔抗血清的制备。
根据Peng等［10］报道的方法免疫新西兰大白兔，采血，摆成最大斜面后在4℃冰箱中静置过夜，使血清自然析出，分装血清，－80℃保存。用DOT—ELISA方法测定血清的效价。
按两倍稀释法［11］测定测定大肠埃希菌K12(原代，C0)对四环素的MIC值(MIC0)，然后在次抑菌浓度条件下(0.5MIC)对大肠埃希菌进行传代培养，每隔12h传代1次，共传代10次，在MH培养基测定其(T10)的MIC值(MIC10)。如果MIC10/MIC04，则说明此菌株对该抗生素表现出耐药性。
1.7 膜蛋白提取。
按照Sabri等［12］的方法提取膜蛋白。挑取单菌落接种于培养基中，振荡培养过夜。以此为种子菌，按1∶50(V/V)的比例接种于另一批培养基中，振荡培养至A600=1.0，6000g收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2次。称菌体湿重，按1∶5(W/V)的比例加入超声波破碎缓冲液悬浮菌体，超声破碎，输出功率50%，每次7.1s，间隔9.9s，超声15min。超声破碎后的菌液，12000g，4℃离心15min，收集上清。上清液100000g，4℃离心40min，弃上清，沉淀溶于一定体积超声缓冲液中。样品分装，－80℃保存。