抗坏血酸有机锗倍半氧化物抑制鸡胚尿囊膜血管生成作用的研究
作者：陈芳 闫静 郭冷秋 贾桂芝 张基庆。
【摘要】 目的研究抗坏血酸有机锗倍半氧化物对鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成的抑制作用。方法在七日龄CAM上植入含不同剂量试药的甲基纤维素膜片，并孵化48 h。解剖显微镜下计数加药组和对照组局部血管数，以此来反映试药对CAM新生血管形成的影响。结果抗坏血酸有机锗倍半氧化物2.5，1.5，0.5 mg/egg剂量相关性减少CAM局部的血管数。结论 抗坏血酸有机锗倍半氧化物对CAM新生血管有显著的抑制作用。
【关键词】 抗坏血酸有机锗倍半氧化物 鸡胚尿囊膜(CAM) 抗血管生成。
Abstract：ObjectiveTo investigate the antiangiogenesis effect of the ascorbic Acid SesquioxyGe(Ⅳ) on chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM). MethodsThe ascorbic acid SesquioxyGe(Ⅳ) loaded with methylcellulose membranes was applied on chicken CAM surface of 7—day—old eggs and incubated for 48 hours .Local vessel density was measured under dissection microscope . The inhibitory effect on CAM angiogenesis was evaluated.ResultsThe Ge(Ⅳ) complex with ascorbic acid at 2.5，1.5 mg/egg and 0.5 mg/egg dose—dependently decreased the density of local blood vessels. ConclusionAscorbic acid SesquioxyGe(Ⅳ) significantly inhibits chicken CAM angiogenesis .
Key words：Ascorbic Acid SesquioxyGe(Ⅳ); Chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM); Antiangiogenesis。
肿瘤生长和转移与新生血管的形成密切相关。临床与动物实验证明，当肿瘤组织生长超过2 mm3时，如果没有新生血管供应充足的氧气和营养物质，肿瘤组织将保持静止或发生退化。近年来,有研究发现某些化疗药物,在小剂量、高频率的给药方式下可以选择性地显著抑制肿瘤组织内新生血管内皮细胞的生长,使肿瘤细胞因为血供不足而生长受阻。这种特殊的给药模式,化疗药物的作用靶位已经不是肿瘤细胞,而是新生的血管内皮细胞,这就称为小剂量化疗(metronomic chemotherapy)或抗血管生成化疗( antiangiogenic chemotherapy)［1，2］。
因此新生血管生成是肿瘤生长和扩散的必要条件，抑制肿瘤血管的生成可以使肿瘤因缺氧、缺血而部分死亡，从而延缓肿瘤生长和抑制肿瘤转移［3］。开展抑制肿瘤血管的药物筛选研究目前已成为抗肿瘤研究的热点。有机锗化合物是人们熟知的具有广谱生物活性的有机化合物，特别是它的抗癌活性研究已引起人们的极大兴趣［4，5］。抗坏血酸有机锗倍半氧化物是本实验室研制合成的一种新型有机锗化合物，经动物肿瘤抑制实验证明，该化合物具有显著的抗肿瘤活性。鸡胚尿囊膜(CAM)是研究体内血管发生的常用模型之一［6，7］。本研究应用CAM技术，观察了抗坏血酸有机锗倍半氧化物对CAM血管生成的影响，从抗血管生成途径对抗坏血酸有机锗倍半氧化物的抗癌作用机制进行了初步探讨。
1 材料与仪器。
1.1 动物与材料昆明种小鼠,体重(20 ±2) g,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。小鼠S180腹水型瘤株由哈尔滨肿瘤医院实验动物中心提供。受精种蛋购于东北农业大学孵化场。
1.2 试剂 甲基纤维素（M450，英国进口分装，北京索莱宝科技有限公司哈尔滨分公司），丙酮（天津市化学试剂六厂三分厂），甲醇（北京化工厂），双蒸水（哈尔滨蒸馏水厂），新洁尔灭（齐齐哈尔市鹤城化学药物有限责任公司）。
1.3 仪器与设备恒温恒湿箱（SPX—250型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂），解剖镜（BA400/500型，麦克奥迪实业有限公司），净化工作台（SW—CJ—/F型，苏州型净化设备厂）。
2 方法。
2.1.1 药物处理因受药物溶解性和小鼠灌胃体积限制，以抗坏血酸有机锗倍半氧化物吐温80（2%水溶液）溶液0.18 g/ml对小鼠灌胃。环磷酰胺组给药为30 mg/kg［8］，即按小鼠平均体重20 g，每次给药量为0.5 ml计算，相当于环磷酰胺的浓度为0.0012 g/ml。
2.1.2 动物分组及处理取本实验室自行传代接种7～9 d的瘤源小鼠,取生长良好的乳白色腹水,以适量无菌生理盐水稀释成瘤细胞悬液,细胞数约为5×106/ml，在小鼠右腋窝皮下接种，每只0.2 ml 。次日，随机将小鼠分为5 组，每组10 只：生理盐水组、抗坏血酸有机锗倍半氧化物给药组（分高、中、低3个剂量）和环磷酰胺组，同时开始给药。本实验采用依次在接种后的第1，5，9天给药的给药方式［8］，于第11天处死小鼠，剥离皮下瘤块称重，计算抑瘤率。
2.2.1 鸡胚的处理 取重量相近（50±5）g，表面无污染、无破损，产出时间在1周以内的新鲜受精鸡卵，以0.1%新洁尔灭清洗，再用清水洗净后用纱布拭干。气室朝上，鸡蛋长轴与蛋托成约60°角，放在温度38 ℃, 相对湿度60%的孵箱内孵育,内置盛有0.1%新洁尔灭的湿盘，每天早晚各翻蛋1 次。
2.2.2 甲基纤维素膜片制备 用双蒸水配制浓度为0.5%的甲基纤维素溶液，过夜使甲基纤维素充分溶解，高压灭菌后备用。在超净台下将甲基纤维素溶液20 μl分多次重复加入同一凹槽内，超净台内吹干，制成直径约4 mm的膜。将膜片轻轻揭下，无菌保存备用（最好在24 h内使用）。