人血小板冻干前负载海藻糖技术的研究

作者：卢发强，刘景汉，欧阳锡林，李锡金，周俊，庄远。

【摘要】 为研究人血小板冻干前负载海藻糖技术与方法，筛选出最佳负载海藻糖实验条件并进一步研究血小板在温度37℃条件下、 负载海藻糖4小时后的平均体积、体外激活程度和聚集反应性的变化，绘制血小板胞内海藻糖负载效率及浓度随温度、时间、胞外海藻糖浓度变化曲线，筛选合适的负载条件，分别以凝血酶、ADP、胶原、瑞斯托霉素4种物质作为血小板激活诱导剂，用血小板聚集仪分别检测血小板负载海藻糖前后的聚集反应性，用流式细胞仪检测分析血小板负载海藻糖前后其膜表面糖蛋白分子CD62p、PAC—1的表达率，加可逆性激活抑制剂PGE—1、腺苷后血小板激活被抑制的程度。结果表明：海藻糖负载效率与孵育时间（2小时后）、温度（30—40℃）呈良好线性关系，在37℃条件下经4小时孵育后负载效率可达60%，载入到胞内海藻糖浓度随胞外海藻糖浓度（＜50 mmol/L﹚的升高而递增；同负载前相比较，血小板平均体积（MPV）、血小板对4种激活诱导剂的最大聚集率均无显著性差别（P0.01），经4小时负载海藻糖后血小板膜表面CD62p表达率升高，但联合添加可逆性激活抑制剂PGE—1、腺苷后CD62p表达率显著下降。结论： 37℃、4小时、胞外海藻糖浓度小于50 mmol/L为合适负载条件，添加可逆性血小板激活抑制剂后，冻干前负载海藻糖过程对血小板的体外激活和聚集活性没有显著影响。

【关键词】 海藻糖。

Process of Human Platelets Loaded with Rehalose before Lyophili—zation。

Abstract The aim of this research was to study the technology and methods of loading lyoprotectant—trehalose into cytoplasm of human platelets before lyophilization，to optimize experimental conditions of loading trehalose，to investigate the changes of platelets response to agonists and activation after incubation of platelets for 4 hours at 37℃ in the presence of lyoprotectant—trehalose，to protract the figures of loading efficiency and intracellular trehalose concentration versus incubation time，temperature and external trehalose concentration，to optimize loading parameters. The response of platelets to different agonists — thrombin，ADP，collagen and ristocetin were measured respectively by APACT2 aggregometer before and after loading trehalose into platelets；the expressions of CD62p and PAC—1 on platelet membranes in the presence and absence of reversible platelets activation inhibitors were measured by flow cytometry respectively before and after loading trehalose into cytoplasm of platelets. The results showed that the loading efficiency was linear to incubation time (2 hours later) and incubation temperature (rang from 30℃ to 40℃)，respectively. The loading efficiency almost reached 60% when the platelets were incubated at 37℃ for 4 hours. The intracellular trehalose concentration was higher with the increase of the extracellular trehalose concentration（＜50 mmol/L﹚. Compared to untreated groups，the values of MPV and aggregation to different agonists in treated groups showed no significant difference，respectively (P0.01). After incubation of platelets for 4 hours，the expression of CD62p increased to some extent，however，the expression of CD62p decreased again when the reversible platelets activation inhibitor PGE—1 and adenosine were added to the incubation buffer. It is concluded that 37℃，4 hours and the extracellular trehalose concentration 50 mmol/L are the optimal conditions for loading with trehalose. The processing of loading with trehalose before platelet lyophilization has no significant effects on response of platelets to agonists and activation.

Key words trehalose；freeze dried platelets；Platelets activation；Aggregation；reversible activation inhibitors。

血小板有效负载海藻糖至胞内是血小板冻干保存的重要环节［1］。冻干保护剂海藻糖是一种分子量较大的非还原性二糖，血小板胞膜对其是非渗透性的［2，3］，如何克服细胞膜的非渗透性而有效将海藻糖载入到血小板胞内是目前国内外学者研究的重点和热点，Wolkers等［2］发明了一种简便有效的将海藻糖负载到血小板胞内的方法——液相内吞方法。本研究在此实验方法的基础上作了进一步的探讨和研究，筛选出负载海藻糖技术的最适实验条件，同时附带实验研究了血小板冻干前负载海藻糖过程对其体外聚集反应性和激活程度的影响。为此，我们既做了反映血小板主要功能活性的实验——聚集实验，同时也做了反映血小板体外激活程度的实验——流式细胞术测定血小板膜糖蛋白分子表达实验。现将血小板冻干制备必经步骤——胞内海藻糖负载技术的系列实验研究结果报告如下。

材料和方法。

浓缩血小板来源。

全部标本均来自解放军总医院输血科2004年1月至2005年8月间无偿献血者200毫升全血中分离的新鲜富含血小板血浆（FPRP）。

主要试剂及仪器。

海藻糖(广西南宁中诺生物科技有限公司)、负载缓冲液A(100 mmol/L NaCl、 10 mmol/L KCl、 10 mmol/L EGTA、 10 mmol/L咪唑、10 μmol/l 前列腺素—E1，pH 6.8)、80%甲醇溶液、硫酸蒽酮试剂、4种血小板聚集反应诱导剂： 凝血酶、ADP、胶原、瑞斯托霉素，荧光标记抗血小板表面糖蛋白单克隆抗体（2—8℃保存）：CD62p—PE、CD61—Percp、PAC—1—FITC、RGDS(PAC－1阻断剂)，含1% 多聚甲醛及0.1%叠氮钠的PBS（pH 7.2）固定液，可逆性血小板激活抑制剂PGE—1和腺苷（Sigma公司产品）。酶标仪、恒温水浴箱、抽真空干燥器、可调温度孵育箱、超声清洗器、分析天平，Nihonkohden(MEK—6108K)血细胞自动分析仪。兰波APACT2血小板聚集仪（美生实业有限公司），FACS流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司），一次性12mm×75mm Falcon试管（Becton Dickinson公司）、CaliBRITE Beads/FACSComp软件（FACS仪器校正，预设获取条件）、CellQuest软件（实验数据获取和分析软件）、微量加样器和加样头。

血小板的洗涤。

将富含血小板血浆320×g离心8分钟，移去红细胞和白细胞，上清液用负载缓冲液A溶液离心洗涤2次（480×g离心22分钟，480×g离心15分钟），用血细胞自动分析仪计数并调整血小板浓度在（1—2）×109/ml之间。

血小板负载海藻糖方法及胞内海藻糖浓度的计算。

将调整好浓度在（1—2）×109/ml范围间的血小板置负载缓冲液A中负载不同浓度海藻糖（浓度范围： 0—80 mmol/L），在不同的孵育温度范围（4—37℃）和不同的孵育时间范围（0.5—4小时）条件下孵育，观察并记录海藻糖载入到血小板胞内的效率及浓度与孵育温度和时间的关系。经孵育之后的血小板溶液用负载缓冲液A洗涤2次（20 000×g台式离心机离心20秒，20 000×g离心45秒），留取血小板沉淀，用80%甲醇提取载入到血小板胞内的海藻糖，80℃条件下加热30分钟。用硫酸蒽酮反应定量载入到血小板胞内的海藻糖，用酶标仪测定用甲醇提取后的海藻糖溶液的吸光度值。绘制6—300 μg/ml范围内的海藻糖的标准曲线。通过与标准曲线核对检测的每个标本的吸光度值，换算成负载到每个血小板胞内的海藻糖摩尔数，海藻糖摩尔数/血小板平均体积的一半即胞内海藻糖的浓度。海藻糖的负载效率（取均值）＝负载到胞内的海藻糖浓度/初始胞外海藻糖浓度×100％。

血小板负载海藻糖前后平均体积的变化。

用血细胞分析仪分别测定。

血小板聚集反应。

用APACT2型血小板聚集仪分别测定血小板在负载海藻糖前后对诱导剂凝血酶(1 U/ml)、胶原(2 μg/ml)、ADP(20 μmol/L)、瑞斯托霉素(1.6 mg/ml)的聚集率，调整血小板计数为250×109/L，取调整好的FPRP 250 μl，加入25 μl诱导剂，记录最大聚集率。

流式细胞术检测血小板膜表面糖蛋白分子的表达。

流式细胞术检测海藻糖负载前后血小板表面激活指标CD62p（磷脂酰丝氨酸，Ps）、PAC—1（活化的gpⅡb/Ⅲa复合物）的表达率，添加可逆性激活抑制剂PGE—1和腺苷后CD62p、PAC—1的表达率，表达用“＋”表示，未表达用“－”表示。实验设阴性对照管：取新鲜血小板，调整细胞数在（1 000—2 000）×109/L，取5 μl加PE同型对照（IgG1 PE）、CD61—PerCP、PAC—1 FITC、RGDS各5 μl；阳性对照管:取血小板5 μl加入2 μl凝血酶充分激活，再加1 μl GPRP (Gly—Pro—Arg—Pro)（防止血小板聚集），在试验管中加入3种抗体各5 μl和血小板5 μl后，轻轻混匀，室温暗处孵育15—20分钟，各管中加入05 ml冷的固定液 (2—8℃)，充分混匀，在2—8℃阴暗处放置30分钟。上机获取数据： 开机后，打开CellQuest，顺序放置对照管和试验管。获取数据： 调出，获取条件、FSC和SSC选择Log方式；获取条件为CD61 PerCP阳性，使用对照管调整FL1和FL2的PMT，使阴性群体位于FL1 vs FL2点图左下角，分别使用PAC—1 FITC / IgG1 PE / CD61 PerCP和PAC—1 FITC+ RGDS / CD 62P PE / CD61 PerCP调整FL2—FL1和FL1—FL2补偿，获取各管的试验数据。结果分析：在CD61 vs SSC点图中找出CD61 PerCP阳性的血小板群 (单个血小板和黏附在白细胞上的血小板)设门。门内做PAC—1 FITC vs CD62P PE点图的双参数分析，统计结果。