双后肢大鼠增龄制备颈椎间盘退变动物模型
王卫明，金大地，瞿东滨 【摘要】 目的 通过截除幼年大鼠双前肢建立颈椎间盘退变的动物模型。方法 健康4周龄雄性SD大鼠76只，随机分为两组，手术组40只，对照组36只。手术组动物麻醉后于双上肢根部截除肢体，分别于术后3、6、9、12个月随机分为4组，每组10只处死大鼠后摄颈椎正侧位X线片，并切取椎体标本制备C2～C3至T2～T3的中矢状面组织学切片，分别进行HE、番红O染色行椎间盘组织学观察。对照组动物分别于实验开始后4、8、12、16个月分为4组进行与实验组相同的处理。结果 截除双前肢后，双后肢大鼠全部存活，实验组大鼠术后9、12个月均出现颈椎间盘退变的X线征象，光镜检查证实其椎间盘均发生了严重的退变，脊索性髓核完全为纤维软骨性髓核取代，软骨终板缺损或消失，基质中胶原纤维排列紊乱，椎间盘突出并骨化。而正常大鼠的椎间盘仅发生轻度退变。结论 本造模方法不损伤动物靶器官正常的解剖结构，成功率高、重复性好，符合人类颈椎间盘退变规律。 【关键词】 疾病模型；动物；颈椎间盘；X线摄片；组织学 【Abstract】 Objective To develop a scientific and reproducible degenerative disc animal model for the study on the cervical disc.Methods The bipedal rats model was developed in 40 infancy SD rats by forelimb amputation.Thirty—six normal rats in the same age served as the control.When the rats in the experimental group were 3，6，9 and 12 months (named E3，E6，E9 and E12 group respectively) and in the control group were 4，8，12 and 16 months (named C4，C8，C12 and C16 group respectively) postoperatively，the vertebral columns from L2～3 to T2～3 were removed and observed under radiographic and histological examination after the rats were sacrificed.Results After forelimb amputation，all the bipedal rats survived.Overload on the cervical spine elicited by this surgical intervention accelerated the process of cervical intervertebral disc degeneration.Radiographic studies of the vertebral columns of all the animals in the E9 and E12 groups revealed evidence of degeneration characterized by disc—space narrowing，anterior osteophyte formation and disorder alignment.Light microscopy revealed that the degeneration of the nucleus pulposus and cartilage endplate were severe and the collagen fibers in the matrix were irregular in bipedal rats’discs.Cervical disc herniation was found in some of the bipedal rats.On the other hand，mild degeneration signs were found in the control group.Conclusion The availability of this experimental model should be valuable for comprehensive understanding of the pathogenesis of cervical degeneration.The degeneration process of the bipedal rats’discs is in agreement with that of human beings. 【Key words】 disease model；animal；cervical disc；radiography；histology 颈椎病是严重影响人类健康的常见病和多发病，是颈椎间盘退变的结果，但其发生的具体机制尚不完全清楚，治疗措施亦有待进一步改善。制备一种可靠的颈椎间盘退变动物模型将为更全面地研究其发病机制提供有力的支持，为可能阻止或逆转椎间盘退变的治疗措施提供试验载体。本研究旨在采用双后肢大鼠模型，利用增龄过程中颈部过量的机械负荷，制备颈椎间盘退变简易可靠的动物模型，最大限度地模拟人类疾病的自然过程。 1 材料与方法 1.1 实验动物与分组 健康4周龄SD雄性大鼠76只（由大连医科大学实验动物中心提供），体重80～100g，随机分为2组，实验组40只，对照组36只。实验组按术后3、6、9、12个月4个时间段分组（E3、E6、E9、E12），每组10只；对照组按实验开始后4、8、12、16个月4个时间段分组（C4、C8、C12、C16），每组9只。 1.2 手术操作与标本处理 实验组大鼠以氯胺酮腹腔内麻醉，剂量0.1g/kg，无菌条件下行腋部环形切口，于肱骨中上1/3离断，将上肢肌肉环形结扎于肢体残端以止血，术后动物于笼中自由活动。对照组大鼠未给予任何处置，两组动物均以市售鼠料喂养。 两组大鼠分别于术后相应时间段以过量乙醚麻醉处死，行颈椎正侧位X线摄片后，剔除周围肌肉，切取颅底到上胸段完整椎体标本，4%多聚甲醛（pH 7.4）4℃固定20h，20%EDTA脱钙，中矢状面连续切片，层厚4μm，分别行HE、番红O染色，制备C2～C3到T2～T3椎间盘单位组织学切片。 1.3 观察指标 X线摄片观察椎间盘退变情况（椎体排列紊乱、椎间隙变窄、相邻椎体骨赘形成）；组织学切片观察椎间盘的退变过程及临近椎体的形态学变化，测量终板软骨及其缺损的宽度。参考Ariga制定的椎间盘退变组织学评价标准［1］进行椎间盘退变的组织学评价，根据终板软骨缺损的宽度占整个终板宽度的比例将椎间盘分为正常（无终板缺损）；轻度退变（终板缺损＜整个终板宽度的25％）；中度退变（终板缺损占整个终板宽度的25％～50％）；重度退变（终板缺损超过整个终板宽度的50％）。终板软骨的缺损根据其带状结构消失或仅有间断的残留带状结构进行判断。 2 结果 2.1 影像学表现 C4、C8、C12、E3、E6组均未发现椎间隙变窄、椎体前缘骨赘形成及椎体排列异常等椎间盘退变的表现（见图1、图2）。C16组中4只，E9、E12组全部大鼠均表现出不同程度的退变征象，以E12组大鼠及C4～C5、C5～C6、C6～C7椎间隙表现明显（见图3、图4）。
图1 C12组颈椎侧位片示椎体排列整齐。
排列紊乱，椎体前缘骨质增生2.2 组织学表现 C4、C8、C12组大鼠大多数椎间盘组织学表现正常（见图5），终板由一薄层透明软骨组成，髓核位于椎间盘的中央，脊索细胞数量较少，呈索条状分布，部分脊索细胞成团分布，极少有退变坏死的脊索细胞。少数切片可见与终板软骨联系紧密的软骨样细胞。髓核四周由纤维环包绕，纤维环具有规则致密的层状结构，胶原束排列整齐平行，以成纤维细胞为主。C16、E3及E6组大部分椎间盘的脊索性髓核皱缩，髓核组织中大多数为软骨样细胞，脊索细胞数量较少且大部分出现变性，软骨终板变薄、前部纤维环层状结构消失，个别椎间隙可见脊索性髓核消失及纤维环的裂隙（见图6）。E9组椎间盘退变加剧，表现为脊索性髓核完全被纤维软骨样组织替代、纤维环出现裂缝、软骨终板变薄并出现缺损（见图7）。个别间隙可见椎间盘突出及相邻椎体的骨赘形成。E12组的椎间盘退变最严重，表现为软骨终板消失、椎间盘突出及相邻椎体前缘骨赘形成（见图8）。纤维环的变性及破裂，使纤维软骨性髓核向椎体边缘突出，超过椎间盘的边界，最终发生软骨内骨化（见图9）。根据终板缺损宽度确定各组中椎间盘退变的半定量分级表明，实验组较对照组椎间盘退变发生的更早且更严重（见表1、图10、图11）。
表1 各组间椎间盘退变病理分级 椎间盘数（%） 图5 C8组大鼠C5~6椎间盘示脊索性髓核位于椎间盘的中央，软骨终板厚度均匀整齐(HEX40)。