灰树花多糖增强肿瘤细胞对放射治疗的敏感性及其分子机理初探
作者：曹卫国，蒋劲松，马韬，赵胜光，韩白衣。
【摘要】 目的 探讨灰树花多糖对增强人肿瘤细胞放射治疗敏感性的作用，研究灰树花多糖与X—射线联合使用后细胞凋亡相关基因Bax的mRNA表达水平的变化并探讨两者协同作用的分子机理。方法 用CCK—8方法测定灰树花多糖与X—射线联合处理后HCT116的细胞存活率（cell survival rate，CSR）；用Apoptosis Ladder Detection Kit进行灰树花多糖与X—射线联合处理后细胞凋亡检测；用RT—PCR方法测定Bax 基因的表达。结果 (1）灰树花多糖与X—射线联合处理对肿瘤细胞的直接杀伤作用高于X—射线单独处理；(2）X射线与灰树花多糖联合处理时细胞发生凋亡；(3）X—射线与灰树花多糖联合处理后细胞发生凋亡的分子机理与细胞凋亡相关基因Bax的表达提高相关。结论 灰树花多糖对肿瘤放射治疗具有明显的增敏作用，联合使用可诱导肿瘤细胞凋亡，此作用可能与凋亡相关基因Bax的表达增加相关。 【关键词】 灰树花多糖；X—射线；细胞凋亡；Bax A Polysaccharide from Grifola frondosa Promotes X—ray induced cell apoptosis through upregulation of Bax in HCT116 cells 【Abstract】 Objective To explore the efficiency of the polysaccharide extracted from Grifola frondosa，in enhancing sensitivity to X—ray irradiation in human colon cancer cells HCT116. The levels of Bax mRNA were investigated in the treatment of the polysaccharide extracted from Grifola frondosa combinated with X—ray treatment to demonstrate the molecular basis for the synergistic effects.Methods HCT116 cell survival rate were monitored by CCK—8 kit. Apoptosis was detected with Apoptosis Ladder Detection Kit in the agarose gel electrophoresis. Bax gene expression was checked by semiquantitative PCR analysis of cellular RNA. Results Here we showed the sensitivity to X—irradiation was detected an increase in the combination of the polysaccharide extracted from Grifola frondosa and X—ray，comparing to X—ray alone. Moreover，the effect of the polysaccharide extracted from Grifola frondosa combined with X—ray on apoptosis was observed by DNA—ladder formation. We also present the evidence that pro—apoptotic gene Bax expresion may be involved in augmented the polysaccharide extracted from Grifola frondosa induced HCT116 cells sensitivity to X—ray irradiation.Conclusion The sensitivity to X—irradiation was increased in the combination of the polysaccharide from Grifola frondosa and X—ray. Moreover，the effect of the polysaccharide from Grifola frondosa combined with X—ray on apoptosis was observed and pro—apoptotic gene Bax expresion may be involved in augmented the polysaccharide extracted from Grifola frondosa induced HCT116 cells sensitivity to X—ray irradiation. 【Key words】 Grifola frondosa; X—ray; apoptosis;Bax 灰树花（Grifola frondosa）是一种生长在亚热带至温带的大型药、食兼用珍稀食用菌，又名栗蘑、贝叶多孔菌等，在分类学上属担子菌纲多孔菌科，我国较早的权威专著《中国的真菌》称其为“灰树花”，日本称之为“舞茸”，其口味鲜美、营养丰富，含有众多活性物质，灰树花多糖就是最主要的一类活性成分。 灰树花多糖除含有β—1，6—支链β—1，3—葡聚糖外还含有大量高度分支化的β—1，3—支链β—1，6—葡聚糖，研究表明，这种特定的结构使其拥有更强的生物调节活性［1］。作为一种生物反应调节剂（BRM），灰树花多糖具有增强免疫功能、抑制肿瘤等广泛的生理活性［2］。 灰树花多糖具有明显的抗肿瘤作用，能激活机体免疫细胞群如T淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞，并可促进多种细胞因子的分泌如IL—2、IL—8、IL—12、γ—INF、TNF—α等，增强肿瘤局部免疫反应，抑制肿瘤发生和转移［3～5］。 放射治疗对正常细胞的毒副作用在一定程度上限制了对恶性肿瘤的治疗作用，灰树花多糖可以通过与放疗的协同作用，提高治疗效果，降低放疗的毒副反应。 1 材料与方法 1.1 细胞培养 用10%牛血清（PAA Laboratories Gmbh）DMEM（PAA Laboratories Gmbh，Hyclone）培养液在37℃，5%ＣＯ２条件下培养HCT116 细胞（human colon cancer cells）。 1.2 细胞毒性分析 取对数生长期HCT116细胞，常规消化成2×104/ml的单细胞悬液，接种于24孔细胞培养板。5%ＣＯ２、37℃环境中培养24h后对HCT116细胞分别用：(1）零处理；(2）灰树花多糖(3μg/ml）处理1天；(3）X—射线（4Gy）处理1天；(4）第1天X—射线（4Gy）处理，第2天灰树花多糖（3μg/ml）处理；(5）第1天、第2天都用X—射线（4Gy）处理细胞。X—射线的处理是采用西门子直线加速器12MeV电子线照射。次日每孔细胞中加入20μl的CCK—8试剂（Dojindo Laboratories），5%ＣＯ２、37℃环境中培养2h后，在酶标仪（BIO—TEK）上波长450nm处读取光密度A值，计算细胞存活率（cell survival rate，CSR）。 细胞存活率（CSR）=试验组A值〖〗对照组A值×100% 1.3 凋亡检测 取对数生长期HCT116细胞，常规消化成2×104/ml的单细胞悬液，接种于 3.5cm培养皿。5%ＣＯ２、37℃环境中培养24h后对HCT116细胞采用第1天X—射线（4Gy），第2天灰树花多糖（3μg/ml）的方法处理，对照组零处理。处理48h后，PBS洗涤细胞，用DNA结合染料Hoechst 33258 （0.5μg/ml ）染色，显微镜下观察和计数。随后上述48h处理细胞采用Apoptosis Ladder Detection Kit （Wako，Osaka，Japan）抽提DNA，2%的琼脂糖磷胶电泳后用SYBR Green I （Molecular Probes，Eugene，OR）染色检测。 1.4 RNA抽提和RT—PCR RNeasy kit (Qiagen)提取处理过的HCT116细胞总RNA并合成相应的cDNA，对Bax基因作RT—PCR，PCR产物通过琼脂糖电泳观察结果。引物序列：Bax正5’— GTCGCCCTTTTCTACTTTGC—3’，Bax反 5’— GGAGGAAGTCCAATGTCCAG—3’； GAPDH正5’—GGTCGTATTGGGCGCCTGGTCACC—3’，GAPDH反，5’—CACACCCATGACGAACATGGGGGC—3’。 1.5 统计学方法 所有数据均以均数表示，采用t检验。 2 实验结果 2.1 灰树花多糖联合X—射线对肿瘤细胞的杀伤作用 近年来对X射线所诱导的细胞凋亡及特点研究较多，表明高能X射线可导致肿瘤细胞发生凋亡，凋亡的出现与放射剂量、时间及细胞固有的放射敏感性都呈一定的相关性。但高能X—射线处理在诱导细胞凋亡上的作用并不显著［5］。为了检测灰树花、X—射线以及二者使用的协同作用，我们对人的肠肿瘤细胞株HCT116分别用：(1）零处理；(2）一天灰树花多糖（3μg/ml）处理；(3）一天X—射线（4Gy）处理；(4）第1天X—射线（4Gy），第2天灰树花多糖（3μg/ml）处理；(5）两天都用X—射线（4Gy）处理。48h后用CCK—8试剂盒测得肿瘤细胞HCT116的生存率，结果如图1所示。我们可以观察到与单用灰树花多糖（细胞存活率为80%）或单用X—射线（细胞存活率为37%）相比，第1天用X—射线辐射处理、第2天用灰树花多糖处理对肿瘤细胞的杀伤作用更强大，细胞存活率降为16.7%，接近两天均采用X—射线辐射的效果（细胞存活率为13.1%）。
第1天，第2天分别用灰树花（3μg/ml）和X—射线(4Gy)处理HCT116细胞，细胞存活率结果用Cell Counting Kit—8检测获得众所周知，放射治疗虽然对肿瘤细胞的杀伤力强，但其毒副作用也十分明显。病人长期放疗会严重影响其生活质量，也阻碍了治疗的深入进行。灰树花多糖是从药食两用真菌灰树花中提取得到的真菌多糖，本身是一种生物反应调节剂，对机体没有副作用。本研究发现：第1天用X—射线辐射处理、第2天改用灰树花多糖处理，不但没有减弱其直接对肿瘤细胞的杀伤能力，而且还能在临床应用时激活病人的免疫机能，大大提高病人的生活质量。 2.2 灰树花多糖联合X—射线诱导肿瘤细胞的细胞凋亡 为了检测灰树花多糖联合X—射线诱导的细胞凋亡，荧光显微镜下观察Hoechst33258染色后的细胞形态。结果发现：第1天X—射线、第2天灰树花多糖联合处理后，大量HCT116细胞核破裂呈分叶状小核，为凋亡细胞的典型形态；而对照组核呈光滑完整的圆形，为正常细胞。我们将联合处理后的细胞用Apoptosis Ladder Detection Kit抽提DNA，电泳时出现了凋亡细胞较为典型的DNA梯形条带，如图2所示，说明灰树花多糖联合X—射线处理可诱导肿瘤细胞的凋亡。 2.2 灰树花多糖联合X—射线诱导肿瘤细胞的细胞凋亡 为了检测灰树花多糖联合X—射线诱导的细胞凋亡，荧光显微镜下观察Hoechst33258染色后的细胞形态。结果发现：第1天X—射线、第2天灰树花多糖联合处理后，大量HCT116细胞核破裂呈分叶状小核，为凋亡细胞的典型形态；而对照组核呈光滑完整的圆形，为正常细胞。我们将联合处理后的细胞用Apoptosis Ladder Detection Kit抽提DNA，电泳时出现了凋亡细胞较为典型的DNA梯形条带，如图2所示，说明灰树花多糖联合X—射线处理可诱导肿瘤细胞的凋亡。
图2 灰树花和X—射线联合处理诱发HCT116细胞凋亡 2.3 灰树花多糖协同X—射线诱导Bax基因的表达 本实验中，人肠癌细胞系HCT116的抑癌基因p53表达为野生型。p53是一种非常重要的抑癌基因，它的功能主要表现为控制细胞的生长和促进细胞凋亡［6，7］，所以p53蛋白质又被称为“警戒蛋白”，在正常细胞中p53基因表达的量是十分低下的，但是有些肿瘤细胞中p53的表达却异常高，HCT116细胞株就是1例。Bax是p53诱导后表达的下游基因，可促使细胞凋亡。通常认为，p53表达异常高的肿瘤细胞中Bax的表达量却很低，从而抑制了肿瘤细胞的凋亡。本研究为了探讨灰树花多糖联合放疗抗肿瘤细胞作用的分子机理，我们用PCR方法，半定量化检测了Bax（Bcl—2 associated X）基因在HCT116细胞中的表达。对HCT116细胞的处理是：(1）零处理；(2）一天灰树花（3μg/ml）；(3）一天X—射线（4Gy）；(4）第1天X—射线（4Gy）、第2天灰树花（3μg/ml）；(5）2天都用X—射线（4Gy）的方法处理。实验结果显示（见图3）：在第1天X—射线、第2天灰树花多糖处理组中Bax的mRNA水平大大提高；连续2天采用X辐射比单日用X辐射的处理中Bax的mRNA表达水平要强，但不及X—射线与灰树花多糖联合处理组所诱导的Bax的mRNA表达量。