层黏素受体下调对蛋白水解酶MMP2、 MMP9、uPA蛋白表达的影

作者：李大江 陈健 陈长宏 王曙光。

【摘要】 目的 研究层黏素受体(LNR)反义硫代磷酸寡核苷酸片段(AsODN) 对人胆管癌QBC939细胞基质蛋白水解酶2(MMP2)、基质蛋白水解酶9(MMP9)以及尿激酶型纤维蛋白溶解酶原激酶(uPA) 蛋白表达的影响。方法 应用Western blotting分析浓度12 μmol/L的LNR AsODN作用48 h后，QBC939细胞MMP2、MMP9以及uPA 蛋白表达水平。结果 LNR AsODN能明显抑制人胆管癌细胞表达MMP2、MMP9以及uPA ,与对照组相比，MMP2、MMP9、uPA蛋白表达下降分别为21.8%、16.5%和9.0%(P0.05)。结论 胆管癌细胞QBC939蛋白水解酶MMP2、MMP9以及uPA基因表达水平与层黏素受体的表达水平明显相关，LNR AsODN表达能够使胆管癌细胞蛋白水解酶基因表达下降，提示层黏素受体在介导胆管癌转移中发挥重要作用。

【关键词】 受体 层黏素 蛋白水解酶 胆管肿瘤 细胞系 寡核苷酸类 反义。

【Abstract】 Objective To investigate the effect of antisense oligodeoxynucleotide (AsODN) of laminin receptor (LNR) on expressions of matrix metalloproteinases2 (MMP2), MMP9 and uPA in human cholangiocarcinoma cells. Methods Protein expressions of MMP2, MMP9 and uPA of cell line QBC939 were analyzed by using Western blotting after lipofectAMINE and AsODN phosphorothioate of LNR at concentrations of 12 μmol/L were cultured for 48 hours. Results Western blotting showed that AsODN could significantly downregulate protein expressions of MMP2, MMP9 and uPap, with decrease rate of 21.8%, 16.5% and 9.0% respectively (P0.05) in comparison with the control group. Conclusions Gene expressions of MMP2, MMP9 and uPA are markedly related to expression of laminin receptor in cholangiocarcinoma cells and can be decreased by expression of LNR AsODN, suggesting an important role of laminin receptor in the invasion and metastasis of cholangiocarcinoma.

【Key words】 Cholangiocarcinoma; Cell line; Receptor, laminin; Oligodeoxynucleotides, antisense; Proteolytic enzyme。

研究发现多种肿瘤细胞表面有层黏素的受体蛋白质——层黏素受体(laminin receptor, LNR)。LNR与包括卵巢癌、 乳腺癌、 肺癌等在内的多种肿瘤的转移能力密切相关［1—3］。基质金属蛋白水解酶2(metalloproteinase2，MMP2)、基质金属蛋白水解酶9(metalloproteinase9，MMP9)以及尿激酶型纤维蛋白溶解酶原激活物(urokinasetype plasminogen activator，uPA)是目前研究得较为广泛的蛋白水解酶。已证实它们参与了多种肿瘤的侵袭转移过程。我们通过运用反义技术，下调胆管癌细胞层黏素受体表达，观察其对MMP2、MMP9、uPA表达的影响。

1 材料与方法。

1.1 细胞培养。

本实验所使用的细胞株(胆管癌QBC939细胞株)为第三军医大学王曙光教授［4］建立的高转移性亚群。在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，于37 ℃、5% CO2条件下培养，每72 h胰酶消化传代1次，取对数期的细胞用于本实验。

1.2 LNR反义寡核苷酸硫代修饰片段(AsODN)的合成。

LNR AsODN序列为：5‘GGCTCCGGACATTGTGAA3‘(翻译起始区)。设空白对照组和顺义寡核苷酸组(SODN组)，后者序列为：5‘TTCACAATGTCCGGAGCC3‘(LNR cDNA序列)。以上寡核苷酸片段由上海生物工程有限公司合成，均为硫代磷酸型(即片段中的磷酸二酯键磷上的氧被硫取代)。

1.3 脂质体包裹寡核苷酸片段转染靶细胞。

寡核苷酸和脂质体复合物在聚苯乙烯管中配制，脂质体lipofectAMINE(德国Boehringer Mannheim公司生产)介导的寡核苷酸细胞转染按产品说明书操作。取对数生长期的QBC939细胞，吸去培养液，无血清OptilMEM(Sigma公司生产)培养基洗1 次，寡核苷酸浓度分别为3、6、12μ mol/L，脂质体终浓度为3 μg/ml。37 ℃ CO2培养箱中孵育6 h后，再加入1 ml OptilMEM完全培养液继续孵育18 h,弃去OptilMEM、寡核苷酸和脂质体复合物，用2 ml DMEM完全培养基继续孵育48 h。对照组以不含寡核苷酸培养液处理。

1.4 流式细胞术检测LNR蛋白表达。

实验分对照组、LNR AsODN组和SODN组3组。LNR AsODN组，又分为3、6、12 μmol/L 3个亚组；SODN组，又分为3、6、12 μmol/L 3个亚组。分别以0.25%胰酶、0.02%乙二胺四乙酸消化制成单细胞悬液。冷磷酸盐缓冲液(PBS)离心洗涤，弃上清，细胞重悬于100 μl LNR抗体稀释液中，37 ℃水浴1 h，抗体浓度为40 μg/ml。冷PBS离心洗涤2次，细胞重悬于1∶50稀释的荧光素异硫氰酸酯标记二抗100 μl，37 ℃水浴30 min。冷PBS离心洗涤2次，除去未结合的多余荧光抗体，最后重悬于500 μl PBS中，流式细胞计数仪(FACS440，USA)检测(4 ℃避光)。阴性对照不加一抗，余步骤相同。

1.5 Western blotting检测各处理组MMP2、MMP9、uPA的蛋白含量。

按照分子克隆手册操作，提取细胞中的蛋白，SDSPAGE电泳和转印，PVDF膜采用硫酸镍胺增强显色。Gel Doc2000凝胶扫描系统上分析，蛋白含量以Volume值表示(Volume：OD×mm2)。

1.6 转染前后细胞侵袭实验。

Transwell Polycarbonate Membrane Plates(美国Corning生产)，为上下室，中间滤膜孔径为8 μm。于下室中加入含趋化因子的无血清培养基,在膜上铺以matrigel 150 μl(120 μg，DMEM液稀释)，37 ℃下放置30 min。上室中加入保温1h的细胞悬液400 μl(细胞数2×105)，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。侵袭至滤膜下表面的细胞用苏木精伊红染色后，随机选择5个400倍显微视野，统计视野中的细胞数。以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。

1.7 统计学处理。

统计资料表达采用±s，采用统计软件SPSS 13.0进行独立样本t检验。