不同方法检测急性呼吸道感染患儿咽拭子与鼻拭子标本诊断呼吸道合

[摘要]目的 比较不同方法检测急性呼吸道感染患儿咽拭子与鼻拭子标本的检测结果。

方法 收集2011年3月～2012年2月本院临床诊断为急性呼吸道感染的315名患儿的咽拭子和鼻拭子标本，采用实时荧光定量qPCR法和传统病毒培养鉴定两种方法同时检测病毒核酸或抗原，比较其结果。

结果 病毒培养鉴定方法中的鼻拭子和咽拭子阳性率分别为12.1%、6.7%，鼻拭子阳性率高于咽拭子（P毕业论文网 　　[关键词]呼吸道合胞病毒；实时荧光定量PCR病毒培养与鉴定；鼻咽拭子 　　[中图分类号] R725.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674—4721（2016）07（c）—0118—04 　　[Abstract]Objective To compare the detection result of throat swab and nasal swab samples from children with acute respiratory tract infection detected by different methods.Methods A total of 315 children with respiratory infection were recruited from March 2011 to February 2012，both throat swabs and nasal swabs were collected.Viral nucleic acid or antigen was detected by both qPCR and virus culture method，the result was compared.Results With virus culture method，the positive rate of nasal swabs was 12.1%，which was higher than 6.7% of throat swabs （P 　　1.3标本采集 　　2011年3月～2012年2月采集广东省中医院急诊及广州医科大学第一附属医院儿科315份符合呼吸道感染诊断患儿的咽拭子及鼻拭子。

1.4标本采集及处理 　　1.4.1咽拭子标本采集方法 采集前需摆放好患儿体位，以免在采集咽拭子时因咽部刺激而大量呕吐，污染标本。

使用压舌板压住患儿舌头，用无菌棉签刮擦咽侧壁及咽后壁，将采集后的拭子置于病毒运送培养基中，以冰盒运送至实验室，放—80℃保存。

1.4.2鼻拭子采集方法 拭子以耳垂与鼻尖方向插入鼻孔3～6 cm，使拭子在鼻内停留15 s，然后轻轻旋转3次，放入病毒运送培养基中，以冰盒运送至实验室，放—80℃保存。

1.4.3标本准备 标本使用时，室温复温，在振荡器上充分混匀拭子标本，将拭子于试管管壁反复挤压、挤干液体；液体经4℃、3000 r/min离心10 min，去除上清液，取沉淀物备用。

1.5病毒培养与免疫荧光鉴定方法 　　1.5.1病毒培养 每个细胞培养管接种标本上清液0.2 ml，作复管，以RSV Long株为阳性质控对照，同时设立细胞阴性对照。

标本36℃吸附2 h后，弃去上清液，加入含4%胎牛血清的病毒培养液2 ml/孔，继续培养6～8 d。

每天观察细胞病变（CPE），单层细胞出现局部大而形态不规则的细胞融合，形成多核巨细胞时则判断为CPE阳性。

进一步作免疫荧光法进行鉴定；阴性标本盲传1～2代后以上述方法进行确认。

1.5.2免疫荧光法鉴定 吸取细胞管的上清液仅留少数几滴，将细胞从管壁刮下，取细胞悬液15 μl至多孔玻璃片待干备用，免疫荧光染色方法按照试剂说明书进行，正置荧光显微镜下观察，细胞内特异性苹果绿荧光视为阳性。

1.6 qPCR 　　1.6.1 RNA的提取 采用荷兰qiagen公司生产的qiagen viral RNA mini extraction试剂盒从拭子标本中提取病毒RNA，按试剂盒操作说明书进行。

1.6.2反应体系与条件 引物和探针序列见表1[3]。

扩增的引物基因区段如下。

扩增反应体系参见说明书；扩增条件：45℃ 10 min，94℃ 10 min，94℃ 30 s，共45个循环；60℃ 1 min。

1.6.3检测结果判断 Ct值统计学处理 　　采用SPSS 11.5统计学软件对数据进行处理，计数资料采用χ2检验，以P医学科技的不断发展，分子生物学技术逐渐被广泛地应用于呼吸道病毒感染快速检测和精确诊断[11]。

在欧美地区，鼻拭子检测法在临床实践中被认为是诊断呼吸道病毒感染最好的方法[12]。

不论鼻拭子还是咽拭子，配以实时荧光定量技术进行RSV—DNA序列检测，都是呼吸道病毒感染快速诊断的有效方法[13]。

RSV病毒、流感病毒等在不同呼吸道标本中的阳性率比较结果显示，不同种类的病毒在不同的采集方法采集到的标本中存在差异[14—15]，提示针对不同种类的病毒需采用不同的采集标本方法。

本研究利用病毒培养法和qPCR法对315例急性呼吸道感染患儿的鼻、咽拭子双份标本进行RSV检测，结果发现鼻拭子标本阳性率高于咽拭子标本，qPCR阳性率高于培养与鉴定检测方法。

与咽拭子病毒培养法结果比较，鼻拭子的qPCR的敏感性和特异性分别为91%、88%，提示该方法适用于上呼吸道感染患儿，且是一种稳定、可靠的RSV检测方法。

综上所述，在临床实践中对急性呼吸道感染患儿的病毒检测推荐使用鼻拭子标本，使用qPCR方法是实现病毒检测的快速方法，值得进一步在临床实验室应用、推广及探索。

[参考文献parison of combined nose—throat swabs with nasal swab for detection of pandemic influenza A/H1N1 2009 virus by real—time reverse transcriptase PCR[J].Pediatrics，2008，122（3）：e615—e620. 　　[3]Kodani M，Yang G，Conklin LM，et al.Application of TaqMan low—density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens[J].J ClinMicrobiol，2011，49（6）：2175—2182. 　　[4]何杨.2011—2012年某院门诊及住院患儿呼吸道病毒感染特征分析[J].中国妇幼保健，2015，30（3）：382—384. 　　[5]刘春艳，肖艳，谢正德，等.2010至2012年门诊和住院儿童急性呼吸道感染病毒病原比较分析[J].中华儿科杂志，2013，51（4）：255—259. 　　[6]郭磊，丁效国，杨丽，等.患儿呼吸道病毒感染的病原学特征研究[J].中华医院感染学杂志parison of nasopharyngeal flocked swabs and aspirates for rapid diagnosis of respiratory viruses in children[J].J Clin Virol，2008，42（1）：65—69. 　　（收稿日期：2016—05—27 本文编辑：祁海文）。