IL10对大鼠原代肝细胞增殖的影响

作者：林羡屏, 黄月红, 郑伟达, 陈运新, 陈治新, 王小众。

【摘要】 　　目的: 探讨IL10对体外培养大鼠原代肝细胞增殖的影响。方法: 胶原蛋白酶原位灌流法分离大鼠肝细胞, RTPCR法检测肝内不同细胞标志基因的表达情况, 对比原代肝细胞与大鼠正常肝组织的检测结果, 进行细胞纯度鉴定; RTPCR法检测原代肝细胞IL10和IL10受体α（IL10Rα）的表达情况; 原代肝细胞分3组培养: 正常组（N组）、 对照组（C组）和IL10干预组（I组）; 通过MTT分析、 台盼兰细胞计数以及流式细胞术检测DNA含量等方法, 了解外源性IL10对肝细胞增殖的影响。结果: 细胞鉴定结果显示, 所有的标志基因在肝组织都可检测到有较高的表达, 原代肝细胞虽高表达肝细胞标志基因, 而肝内其他细胞的标志基因则不表达或低表达。RTPCR检测显示原代肝细胞可表达IL10和IL10Rα。台盼兰细胞计数提示IL10干预48 h, I组平均细胞数仅为C组的71.96%（P0.05）; MTT检测亦显示IL10干预24、 48 h, I组吸光度值分别为C组的88.41%与90.24%（P0.05）; 流式细胞术检测结果表明IL10干预24 h, I组肝细胞峰DNA含量是C组的59.06%, I组较C组降低(P0.01), 甚至低于N组(P0.01)。结论: 分离的原代肝细胞纯度较高, 大鼠原代肝细胞表达IL10/IL10R mRNA, IL10抑制大鼠原代肝细胞增殖。

【关键词】 原代肝细胞; IL10; IL10R; 细胞增殖。

白细胞介素10（interleukin10, IL10）是一种抑制性细胞因子, 具有抗炎症作用, IL10受体α(IL10Rα)介导IL10参与各种各样的效应。IL10对治疗许多肝脏疾病如肝纤维化, 有着良好的应用前景, 动物模型实验已证实外源性IL10具有减轻肝脏炎症损伤和肝纤维化的作用［1—3］。IL10与肝纤维化相关研究的对象, 主要是放在HSC、 KC等细胞, 对肝细胞的研究相对较少; 部分学者从组织学、 血清学水平研究IL10对肝细胞的作用, 针对性不足, 要阐明作用机制还远远不够。基于以往对大鼠原代HSC和肝纤维化的研究［3］, 我们将分离大鼠原代肝细胞, 检测大鼠原代肝细胞IL10/IL10RαmRNA的表达, 流式细胞术检测及MTT实验等方法研究IL10对肝细胞增殖的影响。

1 材料和方法。

1.1 材料 SD大鼠（4只, 雄性, 重250～300 g）, 购自上海实验动物中心; 重组大鼠IL10（深圳晶美生物工程公司）, IV型胶原酶（Sigma公司）, DMEM培养基干粉购自Gibco公司, 小牛血清购自杭州四季青公司, 细胞周期试剂盒购自北京天来生物医学科技有限公司, MTT购自Fluka公司, 台盼兰购自上海捷倍思基因技术有限公司。RNA抽提试剂盒（美国Gentra公司）; AMV逆转录试剂盒由（美国Promega公司）; IL10/IL10Rα引物及相应PCR试剂盒（TaKaRa公司）; 其余引物（生工生物工程公司）, 相应PCR试剂盒（美国Promega公司）; 流式细胞仪（COULTER EPICSXL, Backman公司）。

1.2 方法。

1.2.1 肝细胞的分离、 鉴定、 培养和冻存 取正常SD大鼠, 采用胶原蛋白酶原位灌流法分离出肝细胞, 具体操作方法见参考文献［4］, PAS染色鉴定显示肝细胞纯度, 台盼兰拒染法计数活细胞比例, 按常规细胞冻存方法, 冻存肝细胞于液氮罐中备用［5］, 使用前培养于含10 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中。

1.2.2 原代肝细胞鉴定 分离得到的原代肝细胞以及新鲜肝组织块, 抽提总RNA, RTPCR法检测肝细胞和肝内其他主要细胞的标志基因表达, 相鉴别的细胞和相应的鉴别标志基因如下, 肝细胞白蛋白、 甲胎蛋白(AFP)和细胞色素P450基因CYP2B1和CYP2B2; 胆管细胞CD19, 内皮细胞CD31, Kupffer细胞CD68［6, 7］, 肝内产胶原细胞如星状细胞前胶原酶I（preCollagenI, PCI）。抽提细胞总RNA、 逆转录、 PCR、 凝胶电泳成像的方法步骤参考［8］; 此外结合原代肝细胞PAS染色观察糖原颗粒, 辅助鉴别。引物序列: Albumin: F: 5′TTGCCAAGTACATGTGTGAG3′; R: 5′GGTTCTTCTACAAGAGGCTG3′; 373 bp. CK19: F: 5′GACTTCCTATAGCTATCGCC3′; R: 5′TCTGGTACCAGTCGCGAATC3′; 359 bp. AFP: F: 5′TGAAATTTGCCACGAGACGG3′; R: 5′TGTCATACTGAGCGGCTAAG3′; 272 bp. CYP2B2: F: 5′GAGTTCTTCTCTGGGTTCCTG3′; R: 5′ACTGTGGGTCATGGAGAGCTG3′; 550 bp. CYP8B1: F: 5′AGCACGCAGAAAGTGCTAGAC3′; R: 5′TGTCCTTGGTGCAGCCAAACA3′; 301 bp. CD68: F: GTTCCCTGTGTGTCTGACC(19 bp); R: CTTGGAGCTGAACACATGG(19 bp) 437 bp. CD31: F: CCCATCGAGGAGCAAGAC(18 bp); R: GAGAGTTCTAGCTTCGGCC(19 bp) 419 bp. PCI: F: 5′CATCCACAAGCGTGCTGTAGGTG3′; R: 5′TGCCGTGACCTCAAGATGTGCC3′; 466 bp.

1.2.3 RTPCR检测IL10/IL10Rα的在肝细胞中的表达 总RNA的提取、 逆转录、 PCR、 凝胶电泳成像, 反应参数为: 94℃/5 min→94℃/30 s→55℃退火/45 s→72℃/45 s; 30个循环, 72℃延伸7 min。引物的序列为: IL10扩增片段长度为141 bp: 上游: 5′CAGACCCACATGCTCCGAGA3′; 下游: 5′CAAGGCTTGGCAACCCAAGTA3′; IL10R扩增片段长度为120 bp: 上游: 5′CCGCTGGATGTCTATCCCAAAC3′; 下游: 5′CAGGACAATGTCTGAGCCTTGCTA3′.

1.2.4 肝细胞的干预分组 复苏原代肝细胞, 用含10 mL/L胎牛血清的DMEM培养液稀释, 接种培养板, 50 mL/L CO2培养箱里培养24 h后, 更换培养液, 分为3组: N组加不含胰岛素的100 mL/L胎牛血清DMEM培养液; C组为对照组, 加含2 mg/L胰岛素的100 mL/L胎牛血清DMEM培养液; I组为IL10（5 mg/L）干预组, 使用的培养液同C组。培养时间梯度为24、 48、 72 h。实验重复3次。

1.2.5 台盼兰拒染法检测IL10对肝细胞增殖的影响 以1×108个/L密度接种原代肝细胞于24孔培养板; 按以上条件分组; 在各时间点, 取相应的细胞用吸管轻吹打成细胞悬液; 细胞悬液9滴移入1.5 mL EP管中, 加入4 g/L台盼兰溶液1滴, 混匀, 在血球计数板上加微量细胞悬液。显微镜下, 按公式: 细胞数/毫升原液＝（4大格细胞数之和/4）×104, 计数细胞密度, 连续计数3次, 取其平均值, 每天每组取3孔计数。以时间为横轴, 细胞数为纵轴, 绘制生长曲线。

1.2.6 MTT检测IL10对肝细胞增殖活性的影响 以每孔5×103个细胞接种原代肝细胞于96孔板中, 每列的第1孔不加细胞, 为空白对照孔。实验分组及作用时间如前, 每组每个时间点设7个平行孔, 置于37℃、 50 mL/L CO2培养箱内培养72 h。药物处理后的24、 48、 72 h每组各取7孔加入MTT溶液20 μL, 37℃孵育4 h后弃去孔内培养液, 每孔加入150 μL DMSO溶液振荡10 min, 以空白DMSO孔调零, 在酶联免疫检测仪上测550 nm波长处的每孔吸光度（A）值, 求其平均值。对比不同组别A值差异性, 了解IL10对原代肝细胞增殖活性的影响。

1.2.7 统计学分析 采用SPSS10.0软件进行分析; 均数间比较用方差分析, 数据以x±s表示。

2 结果。

2.1 肝细胞的分离、 鉴定、 培养和冻存 采用胶原蛋白酶原位灌流法分离出大鼠原代肝细胞, 台盼兰计数提示活细胞比例大于90%, 根据细胞形态特点和PAS染色鉴定肝细胞纯度大于95%, 冻存的肝细胞复苏后生长状态良好。

2.2 肝细胞的纯度鉴定 PAS染色显示肝细胞胞质呈均匀的粉红色阳性着色。RTPCR显示肝细胞和肝组织均表达Alb、 AFP、 CYP2B1和CYP2B2, 肝组织还表达CD19、 CD68、 CD31, 而原代肝细胞组不表达或低表达CD19、 CD68、 CD31, 有效的验证了所分离的原代肝细胞有较高的纯度（图1）。