周围神经损伤后细胞凋亡与中药保护作用的实验研究进展
作者：李晓锋, 徐乐勤, 席智杰, 周重建。
Progress of experimental study on cell apoptosis after peripheral nerve injury and the protective effect of Chinese medicine。
随着现代分子生物学、组织工程学、细胞生物学、基因组学的成熟和普及，以及计算机软件的开发与应用，周围神经损伤的基础研究有了较大的发展，目前普遍认为周围神经损伤引起的神经细胞死亡的主要形式是细胞凋亡［1］。本文就近年来对于周围神经损伤后细胞凋亡与保护的实验研究进展做一综述。
1 周围神经损伤后细胞凋亡的机制 周围神经损伤引起的细胞凋亡是多种生理病理因子参与并由凋亡相关基因启动的细胞程序性死亡过程，在此过程中除了凋亡相关的蛋白质，许多炎症介质、细胞因子、钙离子和活性氧等均影响凋亡的发生。现分述如下。
1.1.1 神经生长因子低亲和力受体 近几年的研究结果显示，神经生长因子低亲和力受体p75NTR胞内区的近膜区所含chopper结构功能域的sp75NTR(short p75NTR)可独立诱发细胞凋亡［2，3］。Barker等［4］的实验进一步证明了此观点，在仅表达编码可溶性p75NTR胞内区肽段基因的转基因鼠中，交感神经元和感觉神经元的死亡显著增多。亦有报道成年期周围神经系统不表达p75NTR，但一旦神经受到损伤，周围神经系统的运动及感觉神经元胞体又重新表达p75NTR，同时伴有神经元死亡，表明周围神经损伤后神经元的死亡与p75NTR表达增加有关［5，6］。
1.1.2 肿瘤抑制基因p53 p53是一种抑癌基因，其靶基因负责维持细胞基因组的完整性、DNA损伤的修复和细胞周期的正常运行，在多个可最终导致细胞老化、分化和凋亡的信号途径中起重要作用［7］。p53有野生型和突变型两种表现形式，野生型可诱导凋亡，而突变型与Bcl2功能相似，可抑制细胞凋亡。p53诱导细胞凋亡一般通过三个步骤：（1）转录诱发氧化还原基因；（2）制造活性氧因子；（3）氧化破坏线粒体的细胞膜。Nickells［8］认为，p53表达时细胞凋亡，p53缺失时细胞增殖，它在调节Bcl2和Bax两种蛋白的平衡中起重要的作用。Li等［9］发现，p53 mRNA水平升高与视网膜神经节细胞（retinal ganglial cell，RGC）发生核固缩等凋亡形态学改变相关，提示p53基因在N甲基D天冬氨酸（NmethylDaspartate，NMDA）诱导的鼠RGC凋亡过程中也起着重要作用。
1.1.3 半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶 凋亡执行过程中都会发生蛋白质的特异性酶切，而负责特异性酶切作用的半胱氨酸蛋白酶家族，统称为caspase。Caspase的激活是细胞凋亡发生机制中最关键的环节之一，如Fas、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、p53等均需要在激活caspase后才能导致凋亡。Caspase合成后以酶原和无活性的形式存在，当细胞得到起始凋亡的信号后，caspase通过有序的依次切割而激活级联反应，参与细胞凋亡。Caspase能选择性地切割细胞内3种以上的关键底物，主要有DNA修复酶、细胞周期调节蛋白和结构蛋白以及Bcl2家族成员，导致这些底物活化或失活，继而在细胞凋亡过程中发挥作用。 Caspase家族中最重要的细胞凋亡执行者之一是caspase3，负责对全部或部分关键性蛋白的酶切［10］。正常情况下，细胞质中的caspase3以无活性的酶原形式存在，当细胞凋亡时才被激活为有活性的caspase3，它能够降解细胞骨架、蛋白激酶、转录因子等各种底物，从而引起细胞凋亡［7］，故caspase3活化被视为发生凋亡的分子标志。Chan等［11］发现caspase抑制剂BocDFMK和AcDEVDCHO对新生大鼠臂丛神经根撕脱后的脊髓前角运动神经元有保护作用，但在成年大鼠中却未表现出这种保护作用。
1.1.4 cfos和cjun基因 cfos和cjun是调节细胞增殖、生长、发育和分化的基因。周围神经损伤引起神经元凋亡时，常常伴有此两基因表达的上调，但其与凋亡的关系仍不十分清楚。cjun属于凋亡激活基因，应用阻止cjun基因表达的药物CEP1347/KT7515可抑制神经元的凋亡。新生大鼠神经根切断后给予cjun基因抑制剂，能使脊髓运动神经元凋亡细胞数明显减少［12］。最近研究发现，cjun基因的活化不仅促进神经细胞凋亡，而且在细胞的生存和再生中发挥作用［13］，这两方面的差别可能与神经细胞类型或神经元的发展阶段有关。
1.1.5 Fas与FasL 编码Fas抗原的基因是多种小鼠控制细胞凋亡的基因。FasL与Fas受体(即Apo1又称CD95)，分别属于TNF及其受体(TNF receptor，TNFR)超家族的成员，二者特异性结合，可迅速引起Fas阳性细胞的功能增强，继而触发细胞程序化死亡。Fas/Apo1系统为研究细胞凋亡的激活机制提供了新的途径［14，15］。
1.2 诱导凋亡的小分子有机物与无机物。
1.2.1 氧自由基 氧自由基尤其是活性氧，具有很强的生物活性，易与生物大分子直接或通过一系列过氧化链式反应而破坏生物结构。大量证据显示氧自由基参与介导周围神经损伤引起细胞凋亡的过程。研究表明，内源性或外源性抗氧化剂可抑制细胞凋亡，活性氧升高或内源性抗氧化剂耗竭可导致细胞凋亡，氧自由基引发的膜脂质过氧化产物，是很强的细胞凋亡诱导剂，可通过破坏细胞膜，增加通透性导致钙内流，进而诱导凋亡［16］。脂质过氧化途径主要是直接改变细胞内环境，使细胞内Ca2+浓度超载，能量缺失，蛋白巯基被氧化，从而影响细胞信号传导系统，激发有关的调控基因导致细胞凋亡［17］。
1.2.2 一氧化氮 由一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)催化合成的一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种重要的信息物质，广泛存在于中枢和周围神经系统中。NO参与多种生物活动的调节，包括神经递质的释放和再摄取，线粒体呼吸，DNA合成以及能量代谢。周围神经损伤后，神经元胞体内产生自由基及NO，导致Ca2+和Na+通道关闭，细胞内Ca2+蓄积，引发细胞凋亡［18］。在NO诱导神经细胞凋亡的过程中，伴随有线粒体呼吸链的可逆性抑制，这一抑制作用可能是通过NO修饰线粒体重要膜蛋白而实现的［19］。最近的研究结果表明，NO也有抑制背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）神经元凋亡和促进神经再生的作用，NO对于神经细胞的双向调节作用可能与NOS类型有关，来源于诱导型和神经元型NOS的NO有神经毒性作用，而来源于内皮型NOS的NO有神经保护作用［20］。
1.2.3 Ca2+ 细胞内Ca2+既是损伤因子，又充当第二信使［16］。1977年Kaiser等首次发现细胞内Ca2+浓度升高与凋亡有关［21］。Ca2+作为凋亡信号，通过直接调节某些Ca2+敏感蛋白激酶的活性，令其转移至细胞膜，通过使G蛋白磷酸化，胞内cAMP增加，激活胞核内核酸酶等方式启动细胞凋亡。也有人认为Ca2+耗竭可导致凋亡，如内质网Ca2+储存耗竭是一种细胞凋亡信号，可引起内质网内的Dnasel和核骨架蛋白酶等进入近核区或核基质，并引起生物小分子的释放来诱导凋亡。细胞内钙超载介导NMDA受体过度刺激亦可引起细胞凋亡。Kaya等［22］通过动物实验证实Ca2+拮抗剂能够减少NMDA诱导的RGC凋亡，从而起到神经保护作用。此外，细胞内Ca2+浓度可以影响神经元对神经生长因子（nerve growth factor，NGF）的依赖性。即当细胞内Ca2+浓度下降时，神经元对NGF的依赖性增加，此时去除NGF便可引起神经元凋亡；细胞内Ca2+浓度增加时，依赖性下降，去除NGF不易引起神经细胞凋亡［23］。
1.2.4 兴奋性氨基酸 谷氨酸可诱导成熟神经元凋亡。轴突损伤后，受损神经元释放高浓度的谷氨酸，引起神经兴奋毒性增加，是导致神经细胞死亡的原因之一。也有人认为组织缺血或缺氧导致细胞外的谷氨酸蓄积，高浓度的谷氨酸过度刺激细胞表面的受体，尤其是NMDA受体，引起细胞内的钙离子通道开放，造成细胞内钙离子超载［19］，从而引起一系列的细胞凋亡活动。有实验证实谷氨酸释放抑制剂或谷氨酸受体拮抗剂可保护运动神经元免于凋亡［24］。
1.3.1 原癌基因及相关基因 Bcl2基因是一种重要的凋亡抑制基因。该基因活化后具有阻断细胞凋亡作用，被喻为哺乳动物细胞死亡的解毒剂，也称为凋亡调节抑制基因。与其他的癌基因比较，Bcl2没有促进细胞增殖的活性，相反，其过度表达可抑制由于钙超载、NGF的缺乏、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸及B淀粉样蛋白等所致的神经细胞凋亡发生［25］。 Yamada等［26］发现，坐骨神经撕脱后的大鼠脊髓运动神经元发生大量凋亡，神经元胞体中Bcl2表达减少，提示Bcl2的表达水平决定了脊髓运动神经元损伤后的预后。Liu等［27］证实Bcl2在体内过度表达可阻止幼年和成年大鼠神经根切断后脊髓神经元的凋亡。Natsume等［28］研究发现，在成年大鼠L46神经根撕脱后30 min，接种单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）介导的Bcl2基因于损伤段脊髓前角，2周后在脊髓前角检测到Bcl2大量表达，运动神经元存活率提高至81.8%；而神经根切断后导入同样基因，则运动神经元存活率可提高至75.4%。这些结果提示Bcl2基因对前角运动神经元有一定的保护作用。Bcl2抑制细胞凋亡的作用可能有以下几条途径：(1)通过抑制氧自由基对脂质的氧化作用而延长非增殖细胞的存活以及抑制非凋亡细胞的死亡［19］；(2)在体内Bcl2可与Bax形成异源二聚体，使Bax功能失活而抑制细胞凋亡［19］；(3)抑制内质网膜Ca2+的释放［29］。
1.3.2 高亲和力神经生长因子受体 高亲和力神经生长因子受体A（tropomyosinreceptor kinase A，TrkA）是由原癌基因Trk编码的一种酪氨酸蛋白激酶受体，仅选择性地与NGF结合，共同发挥抗凋亡和促进周围神经再生的作用［2］。周围神经损伤后，TrkA与NGF结合，TrkA自胞外部分向胞浆部分同源二聚化，胞浆部分的酪氨酸激酶相互磷酸化，激活后再对底物磷酸化，启动细胞内信号转导，最终导致细胞结构的变化产生生物效应［30］。
1.3.3 小分子热休克蛋白 许多研究已经表明，大量表达的热休克蛋白（heat shock protein，Hsp）可增加细胞存活率，减少周围神经损伤后神经元凋亡。而小分子热休克蛋白（small Hsp, sHsp）作为细胞凋亡的负调控因子，具有分子伴侣功能，其作用更引人注目。Mehlen等［31］发现，sHsp对抗Fas/FasL介导的细胞凋亡，在结构性表达Fas受体的L929克隆中，人类Hsp27表达可抑制Fas受体介导的细胞凋亡过程，也干扰了十字孢碱介导的凋亡性死亡，其分子机制尚不清楚，可能是Hsp27在caspase级联反应的上游发挥作用［16］。此外，Grothe等［32］在小鼠坐骨神经切断的实验中发现，成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor2，FGF2)能够促进神经细胞存活和轴突生长，而FGF2结合FGFR3参与诱导神经细胞凋亡。
2 周围神经损伤后雪旺细胞生存与凋亡的动态平衡 周围神经损伤后，雪旺细胞可分泌多种对其自身生存与凋亡有着调节作用的因子或生物活性物质。一方面再生轴突局部高浓度的NGF、TrkA、p75NTR共同作用于轴突维持神经元的存活，对再生轴突起促进芽生和趋化作用，并通过自身分泌胰岛素样生长因子2、血小板源性生长因子、神经营养蛋白3、睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor, CNTF）等调节雪旺细胞的生存；另一方面NGF和p75NTR单独作用于增殖的雪旺细胞群促进其凋亡。因此对雪旺细胞而言，存在着对其促进生存和凋亡两种不同的调节机制。β神经调节蛋白（βneuregulin）是正常神经结构中维持雪旺细胞存活最主要的因子。从神经发育和再生过程的调节来看［33］，雪旺细胞通过上述两种不同的调节机制保持其数量的动态平衡，这种平衡在某些雪旺细胞与轴突重新建立1︰1的关系时被打破，得到β神经调节蛋白营养的雪旺细胞存留，而未得到β神经调节蛋白营养的雪旺细胞则发生凋亡。
3 神经保护 周围神经损伤后，保护和提高神经功能是临床治疗的关键和目的，挽救神经细胞、阻止细胞凋亡对于神经再生具有重要的意义。实验证明，谷氨酸盐、NO抑制剂、神经营养因子(neurotrophic factor，NTF)、自由基清除剂、NMDA拮抗剂等均能抑制细胞凋亡，促进神经细胞存活。
3.1 NTF NTF是一类调节神经系统发育、成熟和维持神经功能的蛋白质，这类蛋白质通过旁分泌、自分泌或邻近分泌来影响靶细胞。在胚胎期能促进神经细胞的分化、发育和成熟，在成年期可维持神经细胞存活，在神经损伤后能促进轴索的再生。 周围神经损伤后，神经元凋亡与NTF的缺乏有关。给予外源性的NTF，则可通过由受体介导的内吞作用经轴浆流运输到神经元发挥营养作用，从而抑制神经元的凋亡。体内和体外实验已证明，各种神经营养因子对周围神经损伤具有不同的保护作用［3436］，NGF能促进感觉和交感神经元的存活，脑源性神经营养因子（brainderived neurotrophic factor, BDNF）对运动神经元的发育、成年后运动神经元病变运动神经元的存活以及轴索再生起着十分重要的作用。CNTF能维持脊髓运动神经元的存活，诱导神经元分化并促进副交感、交感和感觉神经元的存活。胶质细胞源性神经营养因子（glial cell linederived neurotrophic factor, GDNF）是近来发现的一种新的NTF，为转化生长因子β(transforming growth factorβ, TGFβ)超家族成员，能特异性地作用于运动神经元，维持其存活，促进轴索再生，并具有阻止受损运动神经元死亡的作用。GDNF还能促进感觉、交感和副交感神经元存活［12］。
3.2 嗅鞘细胞 外周神经损伤后，局部给予嗅鞘细胞有细胞保护作用。嗅鞘细胞的抗凋亡作用可能与以下因素相关：（1）嗅鞘细胞可分泌多种NTF，这种作用在移植后即开始，早于骨骼肌和雪旺细胞反应；（2）嗅鞘细胞还可改变微环境，有利于神经再生；（3）诱导雪旺细胞增生和移动［37］。
3.3 促红细胞生成素 促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)具有神经生长、神经营养和神经保护作用。研究证实EPO可防止后根神经节的神经细胞凋亡，这一作用依赖于蛋白酪氨酸激酶2(Janus kinase2, JAK2)级联信号转导途径的激活［38］。EPO与神经元上的EPO受体结合，激活JAK2，使其磷酸化，进一步介导下游的信号转导。使用JAK2抑制剂AG490可显著减弱EPO的神经保护作用。磷酸化的JAK2可能通过磷酸肌醇3激酶Akt和核因子κB两条信号转导通路实现其抑制凋亡的作用［39］。
3.4 Caspase抑制剂 Caspase抑制剂可以直接抑制神经细胞凋亡，并通过降低免疫炎性反应间接地保护细胞免于继发损伤。Oshitari等［40］通过体外实验证明caspase1、3、8、9抑制剂均可以抑制凋亡，促进细胞存活与轴突再生，并且caspase9抑制剂与CNTF联用的效果最为显著。
4 中药的保护作用 周围神经损伤后的修复与再生是多因子、多因素参与的生理过程，中药正是一种多因素复合物，有其独特的优势。中药有可能提供接近神经细胞生理需求与生长活性因子生长的环境，促进DNA和蛋白质合成，增加神经组织代谢。此外，中药还可以扩张血管，促进毛细血管增生，改善神经的缺血状态，从而抑制细胞凋亡，促进周围神经再生。目前中药的研究主要集中在单体、传统方剂及自拟方剂上，在临床和基础各个领域都取得了一定进展。
4.1 中药单体的保护作用 中药单体的神经保护作用及其机制的研究发展迅速，已成为近年来的热点。相对于西药来说，中药的神经保护作用具有多靶点、毒副作用小、协同效果好等优势；而与复方和单味药相比，从中药中提取的单一化学成分和某一类有效化学成分，则兼具了西药的某些优势；从化学结构看，单体具有确切的结构，药效明确，有助于其神经保护作用的机制研究。近年来研究比较深入的单体有银杏叶提取物(extract of GinkgoBiloba，EGb)、人参皂苷Rg1。此外还有枸杞多糖、鹿茸多肽、辣椒素等。
4.1.1 EGb EGb系银杏叶的提取物，来源广泛，价格低廉，具有较大的实用价值。EGb对神经损伤后脊髓运动神经元和背根神经节感觉神经元有一定的保护作用，其作用机制可能与EGb中含有内酯B，可降低Ca2+水平和对抗谷氨酸神经毒性有关；亦可能与其抑制神经元NOS表达上调有关。作为神经损伤后的治疗辅助药物，EGb不但能促进神经再生，而且对神经元有保护作用［41］。
4.1.2 人参皂苷Rg1 人参皂苷Rg1可抑制DNA断裂，从而防止细胞凋亡。研究发现，人参皂苷Rg1可抑制多巴胺诱导的PC12细胞凋亡，其机制可能与抑制细胞凋亡蛋白酶的激活，增加Bcl2蛋白的表达，减少Bax蛋白的表达有关［42］。此外，人参皂苷Rg1可抑制1甲基4苯基吡啶(1methyl4phenylpyridinium, MPP)诱导的人SHSY5Y细胞凋亡［43，44］，证明人参皂苷Rg1确实有抗神经细胞凋亡的作用。
4.1.3 其他单体 在小鼠坐骨神经损伤后神经再生的研究中，刘小君等［45］发现中药牛膝提取物神经再生素(nerve regeneration factor, NRF)能促进小鼠坐骨神经损伤后的修复及其功能的恢复。超微结构观察表明，实验组有髓神经纤维的髓鞘形态、厚度、成熟度均优于对照组，而变性纤维的数目少于对照组。刘宏鹏等［46］证明枸杞多糖可促进坐骨神经损伤的恢复。Soumyanath等［47］发现积雪草乙醇提取物能显著促进受损坐骨神经的功能恢复和增加轴突生长速率，促进神经再生。李立军等［48］发现鹿茸多肽能促进神经再生。侯炳军［49］发现在损伤局部应用辣椒素，髓鞘和神经纤维间炎性细胞增多，神经纤维间有出血；动作电位潜伏期延长，动作电位峰值下降。
4.2 中药复方的保护作用 周围神经再生所需的微环境不是单一因子的作用，而是多因子、多因素联合作用的生物共济环。从此意义上来讲，有效的中药复方制剂用于促进神经再生时，可提供比例更接近神经生长所需活性因子的环境。研究较为深入的有益气化瘀方、补阳还五汤、理气补血汤、补气通络方等。
4.2.1 益气化瘀方 周重建等［5052］通过建立大鼠神经根损伤模型，证明益气化瘀方能促进雪旺细胞和末梢神经在神经肌肉接头部的聚集、出芽及延伸，加快神经肌肉接头部的再构筑，明显促进神经再生修复进程。
4.2.2 补阳还五汤 刘柏炎等［53］通过实验证实，补阳还五汤能提高神经干细胞的增殖和分化为神经元的能力，上调促碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子及受体、NGF及受体、多聚唾液酸神经细胞黏附因子、生长相关蛋白43的表达，下调神经再生抑制因子A及受体的表达，促进神经功能恢复。底秀敏等［54］通过血清药理学方法观察补阳还五汤对体外培养的雪旺细胞生长情况的影响，结果显示药物组雪旺细胞生长形势及突起长度明显优于对照组。薛金伟等［55］发现补阳还五汤药浴可以明显改善神经损伤局部微循环，使毛细血管数目增多，抑制神经瘢痕形成，促进神经再生。石杜鹃等［56］亦发现补阳还五汤具有修复和保护神经元的作用。
4.2.3 理气补血汤 理气补血汤能够促进雪旺细胞增殖和髓鞘形成，减缓失神经性肌萎缩和变性。在大鼠坐骨神经挤压伤的早期，理气补血汤可抑制成纤维细胞产生过多的胶原，防止神经束内和束间的纤维瘢痕形成［57，58］。
4.2.4 补气通络方 研究证实补气通络方可促进神经传导功能与结构的恢复，改善局部血液循环及神经营养，促进周围神经轴突再生［5961］。
5 结语 中药在非手术治疗周围神经损伤方面具有广阔的应用前景。但目前的研究仍存在以下不足：研究所涉及的中药或复方种类局限；研究内容零乱，在中药作用的有效性上缺乏微观指标；所研究复方多为验方，其配伍组成及配比缺乏客观的科学依据；缺乏对中药多种化学成分对人体综合作用的研究。因此在今后应充分发掘中医的理论资源和中药资源，利用现代医学的研究手段，多靶点、多方位探索中药治疗周围神经损伤的作用机制，并不断发现和补充中药新的药理作用，为临床服务。
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