【运动影响骨代谢的OPG/RANKL/RANK作用机制】 雌激素对骨代谢的作用
摘要:OPG/RANKL/RANK系统是成骨细胞和破骨细胞之间相互作用的信号通道,岂今为止所发现的最重要骨代谢调节机制。
许多因素可以通过影响这个信号系统发挥对骨代谢的调节作用,机械力刺激就是一个非常重要的影响因素。
在运动过程中肌肉不断的对骨骼施加机械力刺激,因此运动对骨骼的影响也可能是通过影响OPG/RANKL/RANK系统的表达而发挥调节作用。
目前主流观点认为“内分泌激素分泌变化是运动影响骨健康的重要机制”,但这种观点值得重新思考,因为机械力可以直接刺激骨组织影响骨代谢,而运动通过改善体内激素分泌环境促进骨代谢平衡这只是一种间接调节方式,并且一般强度的健身运动根本不会明显影响激素的基础分泌,因此需要从更深层次阐明这一机制。
随着OPG/RANKL/RANK骨代谢信号调节系统的发现,可能为这一领域的研究提供新的发展机遇,使我们能够在更微观的层面上探讨运动对骨骼影响的调节机制。
关键词:OPG;RANKL;RANKL;骨代谢;运动 中图分类号:G804.2文献标识码:A文章编号:1004—4590(2010)03—0076—05 Abstract:By far, OPG/RANKL/RANK system is the most important bone metabolism modulator, playing an essential role in the interaction between osteoblasts and osteoclasts. This system is affected by many hormones, cytokines and chemikinds, and mechanical strain is one of important regulating factor. Exercise exerts continuous mechanical strains on bone, therefore it can influence on the OPG/RNAKL/RNAK system. It is well known that endocrinal hormones are the key mechanism in the influence of exercise on bone. However, this concept should be reconsidered, for the fact that mechanical strains can affect bone metabolism directly, and moderate physical activity may not change the secretion of hormone. With the discovery of OPG/RNAKL/RNAK system, it will give out a glim on research in the regulatory mechanism of exercise affecting bone. Key words: OPG; RNAKL; RANKL; bone metabolism; exercise 1 前 言 骨骼似乎是机体内最不活跃的组织,它承担着负重、保护机体重要组织器官、维持生理机能的重要作用。
实际上骨组织非常活跃,每年大约有10%总量的骨组织在更新,骨骼这种以“吸收—构建”为特征的动态平衡称为重建,由成骨细胞和破骨细胞主导的重建过程受到多种因素调节和影响[1]。
机械力就是一个非常重要的影响因素,各种日常生活活动和体育运动对骨骼不断地产生机械力刺激,促进骨组织结构改变,以能够更有效适应各种负荷刺激。
大量的文献报道[2,3]:有规律的体育运动可以提高骨量2%—3%,并认为良性的机械力作用能够使骨组织处于正向骨代谢平衡(positive metabolism balance)。
同时,有研究还表明[4,5]优秀高水平女性运动员骨密度普遍比同龄健康的人群低3%—24%,而优秀耐力运动的男性运动员一些部位的骨密度和骨量比普遍健康人群低19%,而骨代谢率增高23%。
这表明运动是影响骨健康的重要因素,不同的运动方式对骨骼有不同的影响。
运动主要通过影响骨组织代谢而发挥其调节作用,调节骨组织代谢因素有局部机制和内分泌调节机制,维生素D、甲状旁腺、性激素等是非常重要的内分泌调节机制,它们在骨骼生长发育和维持骨量平衡中起到重要的作用。
由于机械力可以直接刺激骨组织影响骨代谢,因此一般健身运动主要还是肌肉对骨骼施加机械力影响骨代谢这一个调节机制,并且这种强度的运动根本不会影响内分泌的基础分泌水平,因此,通过调节内分泌激素的分泌影响骨代谢似乎不是主要的机制,但是机械力影响骨代谢的具体调节机制目前还不十分清楚。
随着分子生物学新理论和新方法的飞速发展,对调节骨代谢的分子机制也有了新的认识,这为阐明运动影响骨骼生长发育、维持骨量平衡的机制开辟了新视野,提供新的发展机会。
OPG/RANKL/RANK系统是新近发现的成骨细胞与破骨细胞之间相互作用的信号通道[6,7,8]。
成骨细胞分泌“核因子κB受体活化因子配体”—RANKL(receptor activator of nuclear factorκB ligand)与破骨细胞上的“核因子κB受体活化因子”—RNAK (receptor activator of nuclear factorκB)结合后促进破骨细胞的分化、成熟及增强其活性,影响许多基因的表达,其中细胞组织蛋白酶K(cathepsin K)和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrat—resistant acid phosphatase, TRAP)就是由破骨细胞分泌的重要骨吸收因子。
同时,成骨细胞又分泌“护骨素”(osteoprotegerin, OPG)与RNAKL竞争结合阻止与RNAK的结合从而降低破骨细胞的活性。
OPG/RANKL/RANK系统是目前已经发现最重要的调节骨组织代谢机制,体育运动影响骨组织代谢也可能是通过影响这个系统而实现对骨骼的调节作用。
下面根据目前最新的文献成果对OPG/RANKL/RANK系统的生理特性、影响因素及与运动的关系作一个简要概括。
2 RNAKL 从RANKL的发现到现在大约有十多年的时间,随着越来越多的研究资料表明它是破骨细胞分化的极重要的调节因子[9,10,11,12]。
许多细胞都表达RNAKL,其包括:成骨细胞前体,成熟成骨细胞、骨髓干细胞及T、B 淋巴细胞等。
RANKL分子由317 个氨基酸组成,有一个N 端胞浆结构域(残基1～48),一个跨膜结构域(残基49～69),一个细胞外结构域(残基70～317),这其中包含一个配基结合位点(残基158～317)。
RANKL主要有二种存在方式:一种是膜结合的同源三聚体形式(member—bound RANKL)(40ku～45 ku);另一种是可溶性形式(soluble RANKL, sRANKL)(31ku)。
可溶性RANKL可由膜结合形式的RANKL裂解产生:蛋白水解酶,如TNF—α转化酶(TNF—αconverting enzyme, TACE)和基质金属酶(matrix metalloproteinase, MMP)等,在氨基酸序列140 位或145 位进行裂解生成sRANKL。
这两种蛋白分子都可以与破骨细胞膜上RNAK受体结合。
许多因素都可以调节RNAKL的表达[12](图1),如甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH),维生素D3(1,25didyoxyvitamin D3, VD3),各种细胞因子(IL—1, IL—6, IL—17,TNF—α,INF—α/β/γ)及机械力的作用。
注释:PTH:甲状旁腺激素;1,25(OH)2 D3:维生素D3;cytokines:细胞因子;CREB:cAMP反应因子结合蛋白;DCR:基因远端调控区;VDR:维生素D受体;STAT3:信号转导与转录激活因子;JAK:Janus激酶;PKA:蛋白激酶A。
PTH 、1,25(OH)2 D3 和gp130都是RNAKL基因表达的正性调节因素。
3 RANK 破骨细胞表面表达RANK,特异与成骨细胞分泌的RNAKL结合,从而建立成骨细胞和破骨细胞之间的信号通道系统。
RANK为I型跨膜蛋白,属于TNF受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)超家族成员,与CD40 的胞外域部分具有高度的同源性,人与大鼠RANK的同源性为70%。
RANK由616 个氨基酸组成,含28 个氨基酸的信号肽,N2端184 个氨基酸位于细胞外,特异与RANKL配体结合,跨膜区很短(21个氨基酸),C2端383 个氨基酸位于细胞内形成RNAK在细胞质内尾端,有TNFR 相关因子(TNF receptor associated factors,TRAFs)结合位点,其中最重要的是TRAF6,当RANKL—RANK配体受体结合后,募集TRAF6与RANKL尾部结合形成三聚体,传递信号,激活转录因子NF—κB(nuclear factor kappa B),从而促进破骨细胞的增殖、分化、成熟、激活其活性,并调节相关基因的转录、表达[9,10,11](图2)。
RANKL和RANK是调节破骨细胞分化、成熟的重要机制,有文献报道[13],缺乏RANKL和RANK的大鼠出现严重的硬骨症(osteopetrosis),同时骨组织缺乏破骨细胞。
应用RANKL抑制剂可以明显降低破骨细胞的数量,提示这是一个十分有前景的治疗骨质疏松的新药物。
以上研究表明RANKL和RANK信号调节系统是破骨细胞分化、成熟和增强活性的重要调节机制。
4 OPG 1997年两个独立的工作小组同时发现OPG,Simonet 等在测序胎鼠小肠cDNA 文库时发现一段表达抑制破骨细胞形成的蛋白序列,引起骨密度升高,将其命名为护骨素(osteotegerin, OPG)。
与此同时,Yasuda等带领的另一个科研小组在研究破骨细胞调控的过程中,也分离出一种可以抑制破骨细胞功能的细胞因子,称之为破骨细胞形成抑制因子(osteoclasto—genesis inhibitor factor,OCIF),经过后来的基因序列分析证实它们是同一种物质[7,8]。
OPG是一种分泌型糖蛋白,属于TNF 受体超家族成员,具有TNF 受体超家族特征性的N 端富含半胱氨酸区域,小鼠OPG与人、大鼠的同源性分别为85 %和95 %,提示OPG 基因在进化中的高度保守。
OPG 分子由401 个氨基酸组成,N端21个氨基酸为信号肽,经糖基化后,成熟的OPG 分子包含380个氨基酸,在胞内先形成55 ku的单体,随后两条肽链间的Cys400形成二硫键,以110 ku 的同源二聚体形式分泌至胞外,每条OPG多肽链包含23 个半胱氨酸,可形成9对二硫键,整个蛋白质分为7 个结构域,并形成3个功能区:TNF 受体结构区,包括结构域1～4,是OPG主要的功能区域,执行抑制破骨细胞的功能;死亡域同源区5 和6,与Fas 蛋白跨膜区形成融合蛋白后具有很强的细胞毒性,引起细胞凋亡;肝素结合结构区,作用尚不明确。
研究发现,体内多种组织细胞可分泌OPG,而破骨细胞是主要的产生来源。
OPG的主要功能是抑制破骨细胞的分化,抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性并诱导其凋亡。
卵巢切除出现骨质疏松的小鼠经OPG注射治疗(剂量:5mg/kg/d)2周后骨量明显上升,破骨细胞数量减少,而OPG转基因小鼠患有全身性的骨质硬化症,破骨细胞数量显著减少,而其它组织器官无明显异常[14]。
OPG基因敲除小鼠破骨细胞数量增多和严重的骨质疏松,约60%的动物伴有大动脉钙化[15]。
而近年来一些学者还把OPG应用于骨质疏松症的临床治疗中。
注释:RANKL:核因子κB受体活化因子配体;RANK:核因子κB受体活化因子;TRAF6:肿瘤坏死因子受体活化因子6;NF—κB:核因子κB;NFATc1:活化T细胞核因子蛋白1;AP—1:反应蛋白1;M—CSF:巨噬细胞集落刺激因子;C—Fms:M—CSF的受体;PLC—γ;磷脂酶Cγ。
5 OPG/RANKL/RANK信号系统的影响因素 OPG/RANKL/RANK系统是新近发现的调节破骨细胞分化的重要信号传导通路,其作用机制是:成骨细胞及骨髓基质细胞表达RANKL,与破骨细胞前体或破骨细胞表面上的RANK结合,促进破骨细胞的分化和激活。
同时成骨细胞及骨髓基质细胞还分泌OPG与RANKL竞争性结合,阻止RANKL与RANK之间的结合,抑制破骨细胞的分化、成熟及活性。
从而成骨细胞与破骨细胞之间通过OPG/RANKL/RANK信号通道构成一个相对稳定的动态调节系统。
RANK本身不具备酶的活性,RNAKL与RANK结合之后必须通过募集反应蛋白(adaptor proteins)才能激活细胞内信号传导系统,主要的反应蛋白有TRAF家族蛋白,其中最重要的是TRAF6。
采用基因敲除和过度表达研究方法证实TRAF6是破骨细胞分化中最重要的反应蛋白,缺乏TRAF6的大鼠出现严重的骨硬化症,同时破骨细胞减少[16]。
RANK在破骨细胞内的尾部有与TRAF分子蛋白结合的位点,其中最关键的反应是RANKL与三个TRAF6形成三聚体,然后激活NF—κB和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen—activated kinases, MAK)。
NF—κB进入核内与基因上相关位点结合,导致NFATc1(nuclear factor activated T—cell cytoplasm 1, NFATc1)的表达,而NFAT c1调节破骨细胞内许多基因的表达,如细胞组织蛋白酶K(cathepsin K)和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrat—resistant acid phosphatase, TRAP),它们都是由破骨细胞分泌的重要骨吸收因子。
同时,NFκ—B、C—Fms(M—CSF的受体)和磷脂酶Cγ(phosphorylate phospholipase Cγ, PLC—γ)通过调节反应蛋白1(adaptor protein 1, AP—1)的c—Fos调节NFATc1的表达[10](图2)。
RANKL受到许多因素的调节(图1),主要分为系统调节和局部调节[9]。
系统调节主要包括一些激素,如:PTH,VD3等,局部调节主要是一些因子,如:IL—1, IL—6, IL—17,TNF—α,INF—α/β/γ。
缺乏PTH的大鼠RANKL的水平和破骨细胞的数量显著降低,表明PTH是RNAKL表达的重要调节激素[17]。
PTH主要通过成骨细胞内的蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)—cAMP环路,并且需要cAMP反应因子结合蛋白(cAMP repose element binding protein, CREB)的参与,CREB的结合位点是基因上的DCR(distal control region)(图1)。
VD3是另一个强大的RANKL表达刺激因素[18],它主要通过影响PTH而发挥调节RNAKL的作用,另外VD3也能够直接调节基因上DCR位点影响相关基因的表达(图1)。
细胞因子(如IL—6)通过gp130信号因子调节RANKL基因的表达(图1),这一调节机制主要激活信号转导与转录激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)和MARK旁路。
实验证明STAT3是最重要的反应因子[20],阻断STAT3或gp130会降低IL—1的调节作用,说明IL—1可能也是通过调节IL—6调节途径实验其功能的。
其它的细胞因子大多表现为促进或减弱RANKL表达的作用,IL—1/3/6/7/11/17和TNF—α具有促进RANKL表达的作用,促进破骨细胞的分化和成熟,而IL—4/5/10/12/13/18、INF—α/β/γ抑制RANKL的表达从而抑制破骨细胞的分化、成熟[9]。
成骨细胞在具有促进骨形成、抑制骨吸收作用的细胞因子的刺激下[9],如TGF—α/β、IL—Iβ、IL—18、VD3,OPG的mRNA和蛋白表达量明显升高[19],在促进骨吸收和抑制骨形成的细胞因子和药物作用下,如:PGE2、糖皮质激素以及雌激素受体拮抗ICI182/180等,降低OPG的mRNA和蛋白表达[21],因此许多细胞因子可以通过影响成骨细胞的OPG表达而影响破骨细胞的活性。
6 运动与OPG/RANKL/RANK系统 机械力刺激是一个重要的OPG/RANKL/RANK系统调节因素。
刘丽等[22]体外细胞培养实验证明骨髓基质细胞在机械力作用下RANKL mRNA表达减少34.4%,而OPG mRNA表达增加73%,提示生理性应力能显著影响大鼠骨髓基质细胞OPG/RANKL mRNA 表达变化,表明生理性应力作用能够延缓骨质吸收从而在分子机制上阐明运动影响骨骼的原因。
Sanchez等人[23]2009年采用3D受力方式研究高强度外力 (大约1和1.67 MPa) 影响成骨细胞的基因表达,成骨细胞受到力后OPG mRNA表达下降,而RANKL mRNA表达没有变化,OPG/RANKL比率下降,这种现象受到IL—6表达上升的调节。
表明过高强度机械力刺激通过影响OPG/RANKL比率而增加破骨细胞活性,骨吸收增加。
其它大量文献也表明对骨组织的机械力刺激能够明显影响OPG/RANKL的表达,从而影响破骨细胞的活性,导致骨代谢率的增快,而且这种影响可能与机械力的性质和作用方式有关。
Rubin等人[24]报道机械力刺激后的成骨细胞RNAKL表达下降,而eNOS表达升高(是一种产生NO的,具有抑制破骨细胞活性的作用)。
Tang等人[25]也报道了经过机械力的刺激后成骨细胞OPG mRNA和蛋白表达上升,而RANKL mRNA和蛋白表达下降。
这些作者都报道机械力刺激能够明显升高OPG mRNA和蛋白表达,而降低RANKL mRNA和蛋白表达,起到抑制破骨细胞分化、成熟和活性作用,骨吸收活性减弱。
与此相反,另一些文献则出现不同的报道[26,27,28]。
在鼠科动物接受机械力振动刺激后出现胫骨RANKL mRNA表达升高。
Zhu等也发现在机械力作用后大鼠下颌骨OPG/RNAKL表达比率下降。
Nakao,Mehrotra等研究小组都报道了在机械力的刺激下成骨细胞的RNAKL表达上调。
这些资料表明机械力刺激通过影响成骨细胞的活性和相关基因的表达(抑制OPG的表达,促进RANKL的表达)而调节破骨细胞的活性。
为什么在机械力刺激后产生不同的结果呢?经过对比这些文献的实验条件发现,他们所应用的机械力刺激强度、频率和持续时间不同从而产生不同的结果。
Kreja等人[29]也提出类似的观点,并且他们在实验中证实RNAKL的表达受到机械力的参数影响。
因此,机械力的施加参数(机械力刺激强度、频率和持续时间)可能是影响OPG,RNAKL表达的重要因素。
由于不同形式机械力刺激对骨组织代谢产生不同的影响,因此在人体运动过程中肌肉对骨骼产生不同方式的机械力刺激,这可能也会对OPG/RANKL的表达产生不同的影响,导致破骨细胞发生不同的反应、骨骼产生不同的变化。
从这个角度来讲健身运动和过度运动对骨骼系统的机械力刺激参数差别很大,因此可能对OPG/RANKL表达的影响也有很大的差异,这可能就是为什么它们对骨骼出现截然相反影响的原因。
Philippou等[30]观察肌肉做离心运动后细胞因子的反应,结果发现运动后6小时和2天后循环血中OPG水平上升而RANKL水平下降,OPG/RANKL比率在运动后6小时升高,表明运动可以明显影响OPG和RNAKL的分泌。
另一研究报道[31]运动性闭经的女性运动员OPG水平下降可能在骨吸收增加、骨密度下降中起到重要的作用。
以上的研究表明运动可以明显影响循环血中OPG/RNAKL,并且OPG/RNAKL系统的变化与运动的形式、强度有关系。
Ziegler等人[32]研究耐力运动(41.195公里或15.8公里长跑)对骨代谢的影响,结果发现耐力运动增加OPG的表达和抑制RNAKL的表达,指出OPG/RANKL可能是运动影响骨骼生长发育、维持骨量平衡的重要机制。
Kerschan—Schinkl等人[33]研究超距离马拉松运动员血清RANKL和OPG的变化及与骨代谢关系,结果表明超长时间耐力运动会导致OPG/RANKL的比率下降,提示这种极限运动能够暂时打破骨代谢的“吸收—再建”动态平衡关系,导致骨吸收增加,形成受到抑制。
从以上的文献中可以发现不同强度的运动对OPG/RNAKL表达的影响是截然相反,即适宜的运动提高OPG表达抑制RANKL表达发挥促进成骨、抑制吸收作用,而过度运动则会抑制OPG、提高RANKL表达表现为成骨作用减弱、骨吸收作用增强。
但是,目前缺乏充足的文献资料阐明不同性质的运动对OPG/RANKL影响,尤其长期运动对OPG/RANKL的影响及与骨代谢的关系。
以上研究提示运动产生的机械力刺激通过影响成骨细胞和破骨细胞之间的信号传导系统而影响骨代谢变化,不现性质的运动由于对骨骼产生不同方式的机械力刺激,因此对OPG和RANKL的表达也产生不同的影响,从而骨组织代谢相应发生不同的变化,这可能是健身运动和过度运动对骨骼产生不同影响的机制。
但是,这方面的研究资料还十分少,需要进一步研究阐明不同形式的运动怎样通过影响OPG/RANKL/RANK信号通道而影响骨骼生长发育和维持骨量平衡。
7 展 望 从体外和体内的动物实验已经证明机械力刺激通过影响OPG/RANKL/RANK信号通道的表达调节成骨细胞和破骨细胞的活性,运动对骨骼不断产生机械力刺激,这种机械力刺激同样也是影响OPG/RANKL/RANK信号通道的重要因素,因此运动可以通过影响成骨细胞和破骨细胞的OPG/RNAL/RNK信号调节系统而调节骨组织代谢。
由于不同的运动方式和强度会对骨骼施加不同性质的机械力刺激,而在细胞培养实验是已经证明不同的机械力刺激强度、频率和持续时间对OPG/RANKL/RANK信号通道的影响也不同,因此不同性质运动产生的机械力刺激也会表现出促进或是抑制破骨细胞活性结果,从而表现为骨密度、骨量升高或是降低。
因此,通过阐明运动中OPG/RANKL/RANK信号通道的变化可以为我们探讨适宜运动增加及过度运动降低骨密度和骨量的机制,从而我们对运动影响骨骼系统的研究从内分泌器官分泌激素的层面深入到分子信号系统更微观的机理上探讨。
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