塞来昔布通过Wnt/β―catenin信号通路对人结肠癌细胞SW480的影响
[摘要] 目的 观察非甾体类抗炎药塞来昔布对体外培养的人结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响，并研究其与Wnt/β—catenin信号通路的关系，探讨塞来昔布抑制结肠肿瘤生长的分子机制。
方法 应用MTT法测定不同浓度塞来昔布（0、20、40、60、80、100 μmol/L）对SW480细胞增殖的影响；应用流式细胞术分析不同浓度塞来昔布（0、20、40、80 μmol/L）处理48 h后对SW480细胞凋亡的影响；应用Western blot法分析不同浓度塞来昔布（0、20、40、80 μmol/L）处理48 h后SW480细胞中β—catenin蛋白和磷酸化的β—catenin蛋白的表达水平。
结果 MTT结果显示，塞来昔布对结肠癌细胞的增殖抑制有浓度依赖性和时间依赖性（P 毕业论文网 [关键词] 塞来昔布；结肠癌；Wnt信号通路；β—catenin [中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673—7210（2016）07（c）—0054—04 随着人们饮食习惯的改变和生活环境的恶化，结肠癌的发病逐年增加，2014年全球估计新发病例数近137万例，居恶性肿瘤发病率的第3位[1]。
大肠癌的发病机制复杂，其治疗包括手术、化疗、放疗及基因治疗在内的多种治疗方法。
近年来非甾体类抗炎药（NSAIDs）的抗肿瘤作用日益受到人们的关注，其可以通过多种途径对肿瘤生长产生抑制作用[2—4]。
而Wnt信号传导通路在结肠癌的发生发展中起着决定性的作用[5—8]，但NSAIDs塞来昔布对Wnt信号通路的作用机制尚不明确。
本研究以人结肠癌SW480细胞为研究对象，观察塞来昔布对结肠癌SW480细胞增殖、凋亡及Wnt/β—catenin信号通路的影响，探讨该作用与Wnt/β—catenin信号通路之间的关系，为其用于结肠的治疗提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要药品、试剂 人结肠癌细胞株SW480购自中南大学肿瘤研究所；塞来昔布（辉瑞制药公司，生产批号：M72189）；新生牛血清（杭州四季清公司）；RPMI1640（Gibco公司，USA）；胰蛋白酶（Amresco公司，USA）；BCA Protein Assay Reagent（PIERCE公司，USA）；兔抗人β—catenin多抗和磷酸化β—catenin多抗（Bioworlde Tecnology Inc公司，USA）；DMSO和MTT（Sigma公司，USA）；PVDF膜（Millipore公司，USA）；考马斯亮蓝、Western blot Luminol Reagent发光试剂和蛋白质分子量标准，Western blot凝胶试剂盒。
1.2 细胞培养 人结肠癌SW480细胞培养于体积分数为10%的新生牛血清和100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素的RPMI—1640培养基中，置于环境为37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。
取对数生长期的SW480细胞用于实验。
1.3 MTT比色法用于细胞生长抑制实验 取对数生长期的SW480细胞，将细胞以2×108/L的密度接种于100 mL培养瓶中，每瓶1 mL，再加完全培养基4 mL，培养24 h，同步化后，每瓶分别加入塞来昔布培养液，终浓度分别为0、20、40、60、80、100 μmol/L，对照组为0 μmol/L。
每浓度设4个复孔，分别在加药后24、48、72 h后，避光下加入5 mg/mL MTT 20 μL，置培养箱内继续培养4 h，弃去培养液，加入二甲基亚砜（DMSO），10 min后酶标仪测490 nm处吸光度（A）值，计算细胞生长抑制率（IR）。
IR的计算公式为：IR（%）=（对照组A值—实验组A值）/对照组A值×100%。
实验重复3次。
1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 设对照组（塞来昔布为0 μmol/L）和实验组（塞来昔布为20、40、80 μmol/L）共4个组别，取对数生长期的SW480细胞用于实验。
孵箱内细胞培育48 h后终止培养，胰酶消化后分别制成单细胞悬液。
调整待测细胞密度为5×105个/mL后上机检测。
实验重复3次。
1.5 Western blot检测细胞内β—catenin蛋白和磷酸化β—catenin蛋白 设对照组（塞来昔布为0 μmol/L）和实验组（塞来昔布为20、40、80 μmol/L）共4个组别。
制备SDSPAGE凝胶，每孔上样40 μg蛋白；取28 mA恒流进行电泳，电泳约30 min后待样品溴酚蓝行至分离胶、积层胶界面，再以120 V恒压、约1.5 h行分离胶电泳；将凝胶中蛋白电转移至PVDF膜上（预先用甲醇处理），温度为4℃，恒流105 mA，3 h；5%脱脂奶粉封闭室温下2 h；4℃孵育一抗，TBST液洗膜3次，每次约5 min；室温下二抗（1∶5000）孵育1 h，TBST液洗膜3次，每次约5 min；于暗室中加入Western blot发光试剂约1 min，X片曝光、显影、定影，胶片扫描后采用Alpha ImagerTM 2200软件测定印迹区带的灰度面积值。
实验重复3遍。
1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计分析软件进行统计分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD—t检验，以P 参考文献] [1] Siegel R，Desantis C，Jemal A. Colorectal cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin，2014，64（2）：104—117. [2] 可飞，郑杰.Hedgehog信号通路对塞来昔布介导抗结肠癌效应的影响[J].江苏医药，2014，40（3）：268—271. [3] 李琛，于良.塞来昔布通过ERK1/2信号通路对肝癌细胞株SMMC—7721增殖、凋亡的影响[J].陕西医学杂志，2013，42（6）：649—651. [4] 张凤香，孙大鹏，范莹，等.塞来昔布促进结直肠癌细胞凋亡的机制研究[J].军医进修学院学报，2012，33（7）：759—762. [5] Kikuchi A. Wnt signaling：its abnormalities and diseases [J]. Seikagaku，2009，81（9）：780—792. [6] El Wakil A，Lalli E. The Wnt/beta—catenin pathway in adrenocortical development and cancer [J]. Mol Cell Endocrinol，2011，332（1—2）：32—37. [7] 冯进武，吴发明，刘朝奇.结肠癌中TLRs、Wnt/β—catenin的表达与肿瘤的相关性研究[J].海南医学，2016，27（2）：254—256. [8] Chen Y，Gruidl M，Remily—Wood E，et al. Quantification of beta—catenin signaling components in coloncancer cell lines，tissue sections，and microdissected tumor cells using reaction monitoring mass spectrometry [J]. J Proteome Res，2010，9（8）：4215—4227. [9] 孙敬国，蒋晓忠.Twist蛋白表达与结肠癌发生发展的关系研究[J].中国全科医学，2011，4（14）：1311—1314. [10] Simoglou C，Gymnopoulou I，Babalis D，et al. Surgery of colon cancer in a district hospital [J]. Hellenic Journal of Surgery，2012，84（1）：71—75. [11] 刘见荣，侯风刚.结肠癌治疗概况[J].辽宁中医药大学学报，2014，16（2）：99—101. [12] Ghosh N，Chaki R，Mandal V，et al. COX—2 as a target for cancer chemotherapy [J]. Pharmacol Rep，2010，62（2）：233—244. [13] 杨春勇，梁庆模.Wnt与MAPK信号通路在肿瘤发生中的串话[J].医学分子生物学杂志，2010，7（5）：441—447. [14] Macdonald BT，Semenov MV，He X. Snap—Shot：Wnt/beta—catenin signaling [J]. Cell，2007，131（6）：1204. [15] Krishnan V，Bryant HU，Macdougald OA. Regulation of bone mass by Wnt signaling [J]. J Clin Invest，2006，116（5）：1202—1209. [16] Seifert JR，Mlodzik M. Frizzled/PCP signalling：a conserved mechanism regulating cell polarity and directed motility [J]. Nat Rev Genet，2007，8（2）：126—138. [17] 马海芝，史振军，杨振淮.蛇葡萄素对大肠癌细胞株 SW480增殖、凋亡的影响[J].现代医院，2015，15（8）：12—14. [18] 毛海波，朱国栋，刘国龙，等.结肠癌细胞株SW480中CD133+的分选及Bmi—1基因的表达[J].中国医学创新，2015，12（17）：15—18. [19] 马宇霆，王丹，王瑞平，等.健脾化瘀方对缺氧微环境下结肠癌SW480细胞生物学行为的影响[J].成都医学院学报，2015，10（3）：265—268. [20] 刘桦，杨晓龙，唐丽，等.NGAL重组蛋白的表达与纯化及其促进结肠癌转移的研究[J].成都医学院学报，2015， 10（2）：142—146，151. [21] 刘声，王笑民，杨国旺，等.扶正防癌方联合化疗对晚期结肠癌患者生活质量及免疫功能的影响[J].世界中医药，2015，10（2）：209—211，215. [22] 金芳玲，蔡忠芳，葛阳丽，等.miRNA—34a靶向抑制Rb/E2F1通路激活增强结肠癌放疗敏感性[J].中国医药导报，2015，12（32）：13—16，29. [23] 杨春勇.奥曲肽与塞来昔布联合应用对人结肠癌SW480细胞及其Wnt/β—catenin信号通路的影响[D].衡阳：南华大学，2011. （收稿日期：2016—03—06 本文编辑：张瑜杰）。