稳定表达EGFR
作者：赵晓蓉，曹利民，彭吉林，王敏，赵晓平，吴砂，李文涵，叶庆， 沈关心。
[摘 要] 目的：建立稳定表达EGFRGFP融合蛋白的细胞系。方法：CaCl2法将pEGFREGFP质粒转化DH5α，酶切鉴定后提取质粒经电穿孔转染CHOK1细胞；以EGFP作为荧光报告分子，克隆化培养以获取单克隆阳性细胞；流式细胞术、荧光显微镜术、Western Blot检测转染细胞EGFRGFP融合蛋白的表达；比较稳定转染细胞及未转染细胞的生长曲线；反复冻存、复苏、传代鉴定细胞表达EGFRGFP融合蛋白的稳定性。结果：获得1株稳定表达EGFRGFP融合蛋白的细胞系，命名为CHOEGFRGFP1，融合蛋白主要表达于细胞膜。稳定转染细胞和未转染细胞生长特性无显著差异。结论：成功获得膜表面稳定表达EGFRGFP融合蛋白的细胞系，为研制以EGFR为靶点的抗肿瘤药物以及研究EGFR与其配体间相互作用奠定了基础。
Establishment of a Cell Line Expressing EGFRGFP Fusion Protein。
Abstract: Objective To establish a cell line expressing epidermal growth factor receptor—enhanced green fluorescent protein (EGFRGFP) fusion protein. Methods The E. coli DH5α was transformed with pEGFREGFP plasmid by CaCl2 method. After identified by restriction enzyme digestion, the plasmid was extracted and then transfected into CHOK1 cells by electroporation.A single clone expressing EGFRGFP fusion protein was obtained by seeding the cells into 96—well plates with one cell per well. GFP—positive clones were detected by flow cytometry, inverted fluorescence microscopy, and western blot analysis for EGFRGFP fusion protein expression. The growth rate of the transfected and untransfected CHOK1 cells was compared. The transfected cell was frozen, thawed, and passaged to identify stability of the expression of EGFRGFP fusion protein by FCM. Results One cell line expressing EGFRGFP fusion protein was obtained stably and named after CHOEGFRGFP1, EGFRGFP fusion protein was localized mainly in the cell membrane. There was no significant difference between the transfected and untranfected CHOK1 cells on cell growth rate. Conclusion A cell line expressing the EGFRGFP fusion protein stably was established. This work provides a basis for further development of antitumor durgs targeting EGFR and investigation of interactions between EGFR and its ligands.
Key words: Epidermal growth factor receptor; EGFP; Cell line。
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是ErbB受体家族成员之一，属于Ⅰ型受体酪氨酸激酶。研究发现[1]，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌及前列腺癌等多种恶性肿瘤中有EGFR的过度表达，并认为EGFR的高表达与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。EGFR已成为肿瘤生物治疗的一个新的靶点。本研究建立了稳定表达EGFRGFP融合蛋白的细胞系，以EGFP作为荧光报告分子，为进一步开展以EGFR为靶点的抗肿瘤治疗以及受体配体相互作用的研究奠定了基础。
1 材料和方法。
1.1 材料。
1.1.1 细胞及培养条件：中国仓鼠卵巢细胞系CHOK1由华中科技大学同济医学院免疫教研室保存，培养于含10％小牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、95％湿度、5% CO2培养箱常规培养。
1.1.2 细菌及质粒：大肠杆菌DH5α菌株由华中科技大学同济医学院免疫学教研室保存，pEGFREGFP质粒由德国哥廷根Max Planck研究院Thomas M Jovin教授惠赠。
1.1.3 主要试剂：限制性内切酶NheⅠ、KpnⅠ（Fermentas MBI公司），PE标记的antiEGFR抗体（BD Pharmigen公司），G418和RPMI 1640培养基（Gibco BRL公司），兔antiEGFR（Santa Cruz 公司），碱性磷酸酶（AP）标记的antirabbit IgG（Sigma公司）。
1.2 实验方法。
1.2.1 pEGFREGFP质粒转化大肠杆菌及鉴定：采用CaCl2法将pEGFREGFP质粒转化DH5α大肠杆菌，挑选卡那霉素抗性菌落碱变性法小量抽提质粒后用限制性内切酶NheⅠ、KpnⅠ双酶切鉴定，对正确的克隆进行扩增培养，大量抽提高纯度质粒用于转染CHOK1细胞。
1.2.2 pEGFREGFP载体转染CHOK1细胞及筛选：采用电穿孔转染法（Eppendorf电穿孔转染仪）将pEGFREGFP质粒转染CHOK1细胞（电压290 V、时间40 μs）。转染后48 h加入G418工作液，终浓度800 μg/ml，每3～5天换培养液。培养14 d后，将细胞有限稀释并克隆化培养于96孔培养板中。培养5 d后，挑选单克隆细胞生长孔于倒置相差荧光显微镜下观察，发绿色荧光的细胞为阳性细胞，待孔中细胞约铺满半孔时，传代于25 ml培养瓶中扩大培养。
1.2.3 EGFRGFP融和蛋白表达检测:①流式细胞仪（FCM）检测：细胞用胰酶消化，PBS洗一次，按每106个细胞10 μl的比例加入PE标记的antihuman EGFR，室温孵育30 min，PBS洗两次用流式细胞仪（FACS Calibur, BD公司）检测。②倒置相差荧光显微镜观察：细胞培养于96孔板，PBS洗一次，按上述比例加入PE标记的antihuman EGFR，室温孵育30 min，PBS洗5次，倒置相差荧光显微镜（Axiovert 40，Zeiss公司）GFP、PE双通道观察细胞中EGFRGFP融和蛋白的表达，定位并照相。③免疫印迹（Western Blot）：细胞用胰酶消化，PBS洗两次，加入细胞裂解液（150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 72, 5 mM EDTA, 1% triton X100, 0.1% SDS, 1 mM PMSF）0.2 ml，室温抽提蛋白质15 min，10 000 rpm离心15 min，取上清，加入上样缓冲液煮沸3 min，10％SDSPAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜，用含5% milk的0.2％ Tween20/TBS (TBST) 4 ℃封闭过夜，再与antirabbit EGFR 37 ℃孵育2 h，TBST洗涤30 min，加入AP标记的antirabbit IgG 37 ℃孵育1 h，TBST洗涤30 min，加入AP底物显色。④EGFRGFP融合蛋白表达稳定性的检测：将所获单克隆阳性细胞反复液氮罐中冻存、复苏10次，每次传代培养4次以上，流式细胞仪检测其EGFRGFP融合蛋白表达。
1.2.4 细胞生长曲线的绘制：将CHOK1细胞及所获单克隆阳性细胞按1.25×104 /孔接种于24孔细胞培养板，转染细胞中加入G418 400 μg/ml，每24小时每组取3孔细胞记数，计算均值，连续6 d，绘制细胞生长曲线。
1.3 统计分析利用SAS软件采用配对t检验对数据进行统计学分析。