低氧肺动脉高压大鼠的肺动脉组织凋亡

作者：刘婷 李运成 钱桂生 张志远 杨昱 王关嵩。

【摘要】 目的 研究bcl2、bax凋亡相关基因在低氧处理大鼠肺动脉中的表达，探讨低氧肺动脉高压的发病机制及防治措施。方法 36只Wistar大鼠随机分为3组，分别为正常对照组、低氧肺动脉高压组、低浓度一氧化碳(CO)组，每组12只，采用原位细胞凋亡、原位杂交、免疫组化等方法检测肺动脉的凋亡状况。结果 ①原位凋亡检测示，正常对照组、低氧肺动脉高压组、低浓度CO组的凋亡率分别为8.1%，37.6%，76.5%，三者间差异显著；②原位杂交显示，正常对照组bax、bcl2杂交呈弱阳性表达。低氧肺动脉高压组bax杂交呈弱阳性表达，低浓度CO组呈强阳性表达，但bcl2杂交可见低氧肺动脉高压组呈强阳性表达，低浓度CO组呈弱阳性表达；③免疫组织化结果表明，低浓度CO组bcl2、bax蛋白均有升高，以bax为著。低氧肺动脉高压组虽然也有表达，但程度较弱，且bcl2表达处于优势。结论 低浓度CO可以调节bcl2、bax凋亡基因的表达，从而促进肺动脉组织的凋亡。

【关键词】 低氧；肺动脉高压；凋亡。

肺动脉高压(PH)病因复杂，可由多种心、肺或肺血管疾病引起。肺血管重建被认为是低氧肺动脉高压的主要病理变化〔1〕，肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖可能是导致PH形成的重要环节，增加平滑肌细胞凋亡可以逆转PH肺血管重建〔2〕。在bcl2基因家族中，bcl2是凋亡抑制基因，bax是凋亡诱导基因，二者比率是影响细胞凋亡的关键。以往体外研究〔2〕发现，低氧可以促进肺动脉平滑肌细胞的增殖，而低浓度CO可以部分抑制低氧对肺动脉平滑肌细胞的作用。为深入探讨其机制，本研究利用全自动缺氧舱复制低氧性PH大鼠模型，分别给予常氧、低氧、低氧与低浓度CO处理，观察肺动脉bcl2、bax基因的变化，探讨PH发病机制，为其防治提供新的思路。

1 材料与方法。

1.1 低氧PH大鼠模型制备及处理分组。

选择健康成年雄性Wistar大鼠36只，体重(200±25)g (购自第三军医大学实验动物中心)，随机分为3组，每组12只。正常对照组：放在室温下依常规方法饲养；低氧PH组：依我所方法建常压低氧仓，保持O2浓度为(10±0.5)%，每天7 h，每周6 d，周日休息，持续3 w；低浓度CO组：每日低氧2 h后通入1次调制好的2 μmol/L的CO 15 min。

1.2 原位细胞凋亡检测。

参照试剂盒说明书方法略加修改。先用PBS (pH 7.4) 漂洗组织切片，然后4% PFA固定组织切片30 min；室温下0.3% H2O2封闭15 min，PBS漂洗2×3 min；0.1% TritonX100 4℃通透10 min，PBS漂洗2×3 min；加入由末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT)，脱氧三磷酸核苷 (dNTP) 和荧光素标记的脱氧三磷酸尿苷(dUTP)组成的混合液30 μl，37℃反应1 h，荧光显微镜下观察并照相；加入过氧化物酶(POD)连接的抗荧光素抗体20 μl，37℃反应30 min，PBS漂洗3×5 min；滴加新配制的0.01%H2O2/0.05%DAB显色液，显微镜下观察，显色约10 min左右，清水冲洗终止反应；苏木素轻度复染，常规系列酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜高倍镜下，观察5～8个视野，计数200个细胞以上，计算阳性细胞百分率。

1.3 原位杂交检测。

参照文献〔3〕方法，所需试剂和器械均经DEPC水处理。取实验组及对照组动物肺动脉组织，基本过程如下：切片在0.1 mol/L PBS (pH 7.2，下同)中漂洗5 min×3，再2×SSC漂洗10 min；蛋白酶K (20 μg/ml，Merck产品) 消化，37℃孵育5 min；0.1 mol/L甘氨酸/0.1 mol/L PBS漂洗5 min；4%多聚甲醛漂洗5 min；0.1 mol/L PBS漂洗5 min×3，再2×SSC漂洗10 min；预杂交后置42℃水浴中2 h；在每张片子上加20 μl地高辛标记探针杂交液，用DEPC水处理的膜覆盖，于湿盒中42℃孵育20 h；取出切片，去膜，4×SSC及PBS充分漂洗；滴加AntiDigAp抗体；NBT/BCIP室温避光显色4～6 h；0.05 mol/L PBS充分漂洗，终止显色反应；中性树胶封片。原位杂交染色结果的判定，以细胞浆和胞膜内出现明确的紫蓝色细颗粒为阳性染色。无阳性信号(—)；弱阳性(+)，阳性细胞≤25%；弱阳性()，阳性细胞26%～50%；强阳性 ()，阳性细胞51%～75%；强阳性()，阳性细胞75%。

1.4 免疫组织化学。

所用的抗体bcl2为兔抗人单克隆抗体，购自加美国Santa Cruz公司，工作浓度1∶50；bax为兔抗人多克隆抗体，购自加美国Santa Cruz公司，工作浓度1∶30；生物素标记的二抗为羊抗兔多克隆抗体，购自武汉博士德公司，工作浓度1∶200。具体方法参见〔4〕。结果判定：背景无颜色，胞浆内着棕黄色颗粒为阳性细胞。无阳性信号(—)；弱阳性(+)，阳性细胞≤25%；弱阳性()，阳性细胞25%～50%；强阳性()，阳性细胞50%～75%；强阳性()，阳性细胞75%。

1.5 统计学分析。

实验结果应用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析，组间率的比较用χ2检验。