一种改进的简便经济的大鼠胰腺腺泡细胞分离提纯方法
【摘要】 目的: 探索一种简单、经济和稳定的胰腺腺泡分离纯化的新方法，并探讨其对细胞功能的影响. 方法: 16只SD大鼠随机分成改进方法组和内灌注方法组，戊巴比妥腹腔麻醉后，其中8只按改进方法迅速切取并剪碎胰腺组织后置于新鲜配制的细胞分离液中，37℃，CO2孵箱中孵育30 min，过滤获得细胞悬液， Hanks液(不含钙离子)清洗后获得胰腺腺泡细胞，另外8只采用内灌注方法获取胰腺腺泡细胞，然后进行细胞计数、活力测定、纯化鉴定和细胞内钙离子测定. 结果: 改进方法所获得的胰腺腺泡数量［(5.0±0.7)×106］、纯度［(78±6)%］与内灌注方法所获得的胰腺腺泡数量［(4.7±0.9)×106］、纯度［(79±7)%］比较无统计学意义(P0.05)，而细胞活力［(93±4)%］显著高于内灌注方法［(84±3)%］(P0.05)，细胞内钙离子浓度（3.62±0.54）显著低于内灌注方法（5.31±0.37）组(P0.05). 结论: 改进方法是一种稳定高效且对细胞活力及功能影响较小的胰腺腺泡细胞分离提纯方法.
0引言。
长期以来，胰腺腺泡细胞的分离、纯化都是非常棘手的难题. 从1978年Williams等创建了经典的胰腺腺泡细胞分离纯化方法［1］以来，人们从未停止对这一难题的探索和改进，采用各种办法进行改进. 这些方法虽然稳定、可靠，但实验步骤繁琐，费用昂贵，实验条件和设备要求高，甚至有些还可以影响细胞的生理状态，引起病理变化，影响实验结果的准确性，不便于推广应用. 本研究参照已有的国内外研究，对现有的胰腺腺泡细胞分离纯化方法进行改进，拟建立一种简单、经济和稳定的胰腺腺泡分离纯化的新方法.
1材料和方法。
1.1材料健康SD大鼠16只，雌雄不拘，体质量150～200 g (西安交通大学医学院动物中心). I型胶原酶(Sigma)，使用时以新鲜配制的Hanks液(不含钙离子)配制0.5 g/L细胞分离液. 100 mL/L的小牛血清(四季青生物公司)DMEM组织培养液(Gibico). Fluo3/AM（Molecular Probes Inc, USA）.
1.2方法。
1.2.1胰腺腺泡细胞的分离、纯化大鼠16只，术前12 h禁食，不禁水. 25 g/L戊巴比妥钠按每100 g体质量0.12 mL进行腹腔内注射麻醉后，将其浸于750 mL/L乙醇中30 min消毒. 其中8只动物在无菌条件下，固定于超净工作台上，开腹后于肝脏下缘寻找十二指肠和胰腺，迅速切取胰腺约1 g (1 cm×1 cm)浸于100 mL/L小牛血清DMEM培养液中，洗净血液、去除脂肪和淋巴等组织后，将其移入盛有5 mL预热至37℃新鲜配置的细胞分离液的烧杯中，将胰腺组织剪碎为0.5~2.0 mm的小块，置于37℃， 50 mL/L CO2孵箱中孵育30 min，依次用100目筛网和200目筛网过滤得细胞悬液，Hanks液(不含钙离子)清洗两次（800 r/min，5 min），收集细胞加5 mL 100 mL/L小牛血清DMEM培养液混匀后移入培养瓶，置于37℃，50 mL/L CO2孵箱内. 另外8只动物，采用内灌注方法提取胰腺腺泡细胞培养［2］.
1.2.2细胞计数吸取20 μL细胞悬液，加到细胞计数板上，在倒置显微镜下(20×物镜)计数细胞数. 按公式计算，细胞数目=(4大格细胞数之和/4)×104×细胞原液量(mL).
1.2.3细胞活性测定(台盼蓝排斥实验)吸取2 μL细胞悬液加入4 g/L台盼蓝5 μL，混匀后在3 min内计数活细胞和死细胞数目，计算细胞活性率（细胞活性率=（细胞总数—死细胞数）/细胞总数）.
1.2.4腺泡细胞纯化与鉴定将细胞悬液调整到1×108～1×109个/L浓度后，制备细胞涂片，分别给予HE染色和酶原颗粒的亚甲蓝染色. 方法如下:涂片用亚甲蓝溶液染色后，以0.2 moL/L醋酸盐缓冲液分色并用4 g/L钼酸胺溶液处理后观察，计算出腺泡细胞纯化率. 分别计数10个高倍视野的HE切片上的细胞数和亚甲蓝染色切片上的细胞数，计算出腺泡细胞纯化率.
1.2.5细胞内Ca2+测定将所获得的胰腺腺泡细胞用PBS洗两遍，调整细胞密度为5×108个/L，取2 mL加入Fluo3/AMDMSO，使其终浓度为5 μmoL/L，混匀，置入37℃水浴箱中避光孵育30~45 min，PBS洗3遍后加1 mL PBS混匀，于流式细胞仪上检测，激发波长488 nm，随机测定单个胰腺泡细胞的荧光强度值，取10万个胰腺腺泡细胞的荧光强度值的平均值为每份标本的测定值.
统计学处理: 数据均以x±s表示，切应用SPSS 13.0统计软件进行独立样本t检验，P0.05有统计学意义.
2结果。
2.1细胞计数采用改进方法平均每克大鼠胰腺组织可提取细胞数量为(5.0±0.7)×106，与内灌注方法相比较无统计学意义（P0.05, 表1).表1不同方法分离胰腺腺泡细胞4项指标的比较。
2.2细胞活性率台盼蓝染色蓝染者为死细胞. 改进方法组活细胞率为(93±4)%，显著低于内灌注方法（P0.05, 图1, 表1).