基质金属蛋白酶—2在mRNA水平表达与乳腺癌转移关系及临床病理相关
作者：武云飞，姜颖，肖岷，庄永志。
［摘要］ 目的 探讨乳腺癌MMP—2 mRNA表达量与乳腺癌转移的关系及临床意义。方法 采用荧光定量RT—PCR方法，分析32例乳腺原发癌和与其配对淋巴结转移癌的MMP—2 mRNA表达量，分析86例临床乳腺癌标本的MMP—2 mRNA表达与临床病理类型、临床分期、雌孕激素受体及Her—2表达的关系。结果 32例乳腺转移癌MMP—2 mRNA表达量低于原发癌（P＜0.05）；肿瘤≤2 cm的MMP—2 mRNA表达量高于肿瘤＞2 cm的表达量（P＜0.05）;组织分级为Ⅱ级、Ⅲ级的MMP—2 mRNA表达量低于Ⅰ级（P＜0.05）;淋巴结4个以上阳性组MMP—2 mRNA表达量低于淋巴结1～3个阴性组（P＜0.05）；MMP—2 mRNA表达量经过统计学分析与临床分期、病理类型、雌孕激素受体及Her—2表达无关。结论 MMP—2在mRNA转录水平的表达存在负反馈调节。MMP—2 mRNA转录水平的表达与乳腺癌转移有关，MMP—2在转录水平的表达在肿瘤较小时上调，随着肿瘤的增大其转录水平表达下调，随着肿瘤恶性程度的增加，其转录水平的表达量在下降，在肿瘤发生的早期表达上调，随着肿瘤的进展表达量下调。
Clinical and pathologic significance and relationship between expression of matrixmetalloproteinase 2 mRNA and breast cancer metastasis。
［Abstract］ Objective To discuss the clinical and pathology significance of matrix metalloproteinase 2,MMP—2 mRNA and the relationship between MMP—2 mRNA expression and breast cancer metastasis.Methods Detect MMP—2 mRNA expression of 32 breast cancer, metastatic lymphnode and 86 clinical breast cancer samples by fluorence—quantitative RT—PCR and analyse the relativity between MMP—2 mRNA expression and clinical,pathology factors,the status of ER/PR and Her—2.Results MMP—2 mRNA expression in 32 metastatic lymph node is lower than in primary breast cancer（P＜0.05）.The mRNA expression of MMP—2 in tumor 2 cm is lower than in tumor≤2 cm（P＜0.05）.The MMP—2 mRNA expression in stage Ⅱ,Ⅲ is lower than in stage Ⅰ（P＜0.05）.The mRNA expression of MMP—2 in more than 4 lymphnodes positive is lower than in lymphnode 1—3 positive （P＜0.05）.The MMP—2 mRNA expression is irrelated with tissue grade,pathologic type,ER,PR and Her—2.Conclusion MMP—2 mRNA expression is upregulated in early clinical stage,lymph node metastatic early stage,and down regulated with tumor progressing.MMP—2 mRNA expression is related with the metastasis of breast cancer.
［Key words］ breast cancer;matrix metalloproteinase 2;metastasis;RT—PCR。
肿瘤的转移是一个极其复杂的过程，这一过程包括肿瘤细胞从原发灶脱离，穿越基膜及细胞外基质浸润迁移并进入血管，黏附于血管内皮，进入循环系统并随血流到达远处，穿出血管侵入细胞外基质并形成转移灶。癌细胞脱离原发灶后，穿越组织屏障是转移的关键步骤。细胞外基质（ECM）和基膜（BM）是肿瘤生长和扩散的自然屏障，基质金属蛋白酶9（MMP—9）是肿瘤细胞产生或诱导产生的蛋白酶类，几乎可以降解BM和ECM中的所有成分，协助肿瘤细胞转移。本研究中我院采用荧光定量RT—PCR方法检测了86例乳腺原发癌和32例配对转移癌中的MMP—2 mRNA定量表达，对MMP—2在mRNA水平的表达与乳腺癌转移及临床病理因素的相关性进行探讨。
1 资料与方法。
1.1 一般资料 收集我院86例2003年6月～2005年6月进行乳腺癌根治术的病例，术中立即取材，分别取原发癌和淋巴结转移癌，所有淋巴结转移癌均经过病理组织学评价，选取癌细胞在75%以上的淋巴结。患者年龄28～76岁，平均48岁。原发癌86例，其中配对淋巴结转移癌32例；Ⅰ期7例，Ⅱ期55例，Ⅲ期24例；淋巴结阳性53例，淋巴结阴性33例；单纯癌6例，浸润性导管癌69例，髓样癌7例，浸润性小叶癌2例，腺癌2例；病理组织学分级Ⅰ级27例，Ⅱ级46例，Ⅲ级13例。对瘤组织进行ER、PR免疫组化检测，阳性判定标准为阳性细胞数达30%以上；采用免疫组化方法检测Her—2受体，阳性数达10%以上为阳性。组织标本冻存于—80 ℃冰箱中。标本收集过程中采用DEPC处理过的Epindoff管分装，注意避免RNA酶污染。
1.2 方法。
1.2.1 RNA的提取 采用Trizol试剂提取组织标本RNA，核酸分析仪测定浓度并进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
1.2.2 MMP—2引物与Tagman探针的设计与合成 引物设计采用Oligo 6.0软件设计，管家基因采用GAPDH。每一条引物与探针序列均与Blast进行同源性比较，引物与探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
Forward 5’—CGC TCA GAT CCG TGG TGA GAT—3’。
Reverse 5’—CGG GAG CTC AGG CCA GAA TG—3’。
探针：5’（FAM）—TTC TTC TTC AAG GAC CGT TCA TTT GGC—3’（TAMRA）。
Forward 5’—GAA GGT GAA GGT CGG AGT C—3’。
Reverse 5’—GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC—3’。
探针：5’（FAM）—CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC—3’（TAMRA）。
1.2.3 荧光定量RT—PCR实验 采用ThermoscriptTMplus/platinumR一步法试剂盒进行荧光定量RT—PCR实验，反应条件按照试剂盒说明书进行，反应体系调定为20 μl。荧光定量RT—PCR结果计算：CT值代表每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所进行的循环数。以MMP—2的CT值减去GAPDH的CT值得到ΔCT值，分组以最小CT值作为矫正数，得到ΔΔCT值，计算2—ΔΔCT值，以2—ΔΔCT值为RNA表达量。
1.3 统计学方法 乳腺原发癌与配对淋巴结转移癌比较采用配对t检验，临床病理因素组间比较采用组间t检验。
2 结果。
2.1 32例乳腺原发癌和配对淋巴结转移癌的MMP—2 mRNA表达量的对比 32例乳腺原发癌与相应配对淋巴结转移癌中MMP—2 mRNA表达量的对比分析，结果t=—3.273,P=0.021（P＜0.05）。结果表明32例配对转移淋巴结中MMP—2 mRNA表达量低于32例乳腺原发癌中MMP—2 mRNA表达量，组间比较差异有显著性。结果见表1。表1 32例乳腺原发癌和配对淋巴结转移癌的MMP—2 mRNA表达量对比。
2.2 MMP—2 mRNA表达量与临床病理因素的关系 结果见表2。 表2 MMP—2 mRNA表达量与临床病理因素的关系。
2.3 MMP—2 mRNA表达量与ER、PR及Her—2表达的关系 结果见表3。表3 MMP—2 mRNA表达量与ER、PR及Her—2表达的关系。
3 讨论。
肿瘤的浸润和转移是极其复杂的多步骤序贯过程，是众多因子相互协调以及共同作用的结果。肿瘤的转移过程是肿瘤细胞与宿主相互作用的极其复杂的一系列过程，现在人们认为肿瘤细胞从原发灶到转移灶必须经历以下过程［1］：（1）克隆性扩增，生长，异质化，血管生成，形成转移性亚克隆；（2）黏附并进入基膜；（3）通过细胞外基质；（4）侵入血管，与宿主淋巴细胞相互作用；（5）形成肿瘤细胞栓子；（6）肿瘤细胞与基膜黏附；（7）侵出血管；（8）转移灶形成；（9）肿瘤血管形成；（10）转移灶生长。由此可见肿瘤细胞从原发灶到转移器官必须多次穿透基膜，因此研究基膜的降解对于认识肿瘤浸润、转移机制相当重要。