雌激素对穹隆海马伞切断大鼠脑内nAchR的干预作用
作者：张延霞，郭宗君，崔瑞耀，骆刚。
【摘要】 目的 以双侧穹隆海马伞切断制作阿尔茨海默病（AD）大鼠模型，观察脑内海马CA1区和皮层区烟碱型乙酰胆碱受体（nAchR）表达的变化，探讨与 AD相关的发病机制，并观察雌激素的干预作用。方法 健康雌性Wistar大鼠，随机分为3组：（1）穹隆海马伞切断组；（2）雌激素治疗组；（3）假手术对照组；每组大鼠5只。在脑立体定位仪上切断穹隆海马伞，建立模拟AD动物模型。应用免疫组织化学技术观察AD大鼠海马CA1区和皮层区的nAchR阳性细胞表达的变化，以及应用外源性雌激素的干预作用。结果 与对照组大鼠脑内nAchR表达比较，穹隆海马伞切断组大鼠脑内海马CA1区、皮层区nAchR表达显著减少（P＜0．05）；与穹隆海马伞切断组比较，雌激素治疗组海马CA1 区、皮层区nAchR表达显著增加（P＜0．01），但与对照组比较无显著差异（P＞0．05）。结论 穹隆海马伞切断组大鼠脑内海马CA1区、皮层区nAchR的阳性细胞显著减少，补充外源性雌激素治疗后，上述各脑区内的nAchR表达显著增加。nAchR的变化与AD的病理变化过程密切相关，补充雌激素可以干预这种病理过程。
【关键词】 穹隆海马伞切断；烟碱型乙酰胆碱受体；雌激素；阿尔茨海默病。
Abstract： Objective To observe the expression of nicotinic acetylcholine receptor (nAchR) in the brain‘s fimbria/fornix transected rats, the effect of ectogenic estrogen on it, and its relation with Alzhelmer‘s disease (AD). Methods Healthy female Wistar rats were divided into three groups at random: (1) fimbria/fornix transection group, (2) estrogen treatment group, and (3) control group. There were five rats in every group. And their fimbria/fornix was transected in order that AD models were made. Immunoreactive cells with nAchR were stained by immunohistochemical way so that the expression varieties of nAchR immunoreactive cells could be observed in hippocampus CA1 and cortex. Results In fimbria/fornix transection group, the expression of nAchR obviously decreased in the observed areas of the brain (P0.05 ). In estrogen treatment group, the expression of nAchR increased remarkably (P0.01 ). Conclusion The cells expressing nAchR clearly decrease in the areas of CA1 and cortex of rats when their fimbria/fornix is transected, but the cell number increases significanly if ectogenic estrogen is added. The change in nAchR is closely relative with AD whose pathological course can be influenced by the intervention of estrogen.
Key words： fimbriafornix; transection; nicotinic acetylcholine receptor; estrogen; Alzhelmer‘s disease。
阿尔茨海默病（Alzheimer‘s Disease，AD）是一种以认知记忆障碍为主要特征的进行性神经系统疾病。其特征性病理改变为老年斑，神经元纤维缠结及神经元丢失以及多种神经递质和受体的改变。AD是神经系统进行性退行性疾病，其病因可能是多源性的，其中，乙酰胆碱受体与AD发病有密切的关系[1]。研究表明，雌激素与AD有密切关系[2]。本实验利用穹隆海马伞切断的方法模拟制作AD大鼠模型，观察AD发生时和给予外源性雌激素（E2）时，大鼠脑内海马CA1区和皮层区烟碱型乙酰胆碱受体nAchR表达的改变，进一步研究E2与nAchR的关系以及作用机制，从而为临床E2治疗AD提供理论基础。
1 材料和方法。
1．1 实验动物和分组。
健康雌性Wistar大鼠，由山东大学医学院动物中心提供，5月龄，体质量220~250 g。随机分成三组：(1）穹隆海马伞切断组；(2）雌激素治疗组；（3）假手术对照组；每组5只大鼠。
1．2 实验方法。
121 模型制作。
双侧穹隆海马伞切断： 经10%水合氯醛（300 mg/kg，ip）麻醉后，将大鼠固定于江湾IC型脑立体定位仪，按常规消毒、剪毛、正中切开头皮，暴露出颅骨，参照Paxinos 和Watson的大鼠脑立体定位图谱与既往研究方法[3,4]。在前囟后2．2~2．5 mm，中线外1 mm 处，用电动开颅器凿开颅骨，切开硬脑膜，用自制双刃刀先置于上述部位的脑表面，接着降刀 4．5 mm，外移1 mm，然后再降刀1 mm，外移1．5 mm，最后上下抽动刀约20次，以保证海马伞外侧缘完全切断。清洁颅面，缝合头皮，常规饲养[5,6]。
122 动物灌注、固定、取材 模型大鼠经10%的水合氯醛腹腔麻醉，开胸，心脏灌洗，生理盐水250 ml，快速冲洗2 min，冲净血液后，4%的多聚甲醛灌注固定5~10 min 后，断头取脑，锯开颅盖骨，剪开硬脑膜，切下组织块放入4%的多聚甲醛后固定30~40 min，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。
123 免疫组织化学染色检测（SABC法）。
切片入nAchR抗体（1：200，博士德公司）孵育4 ℃ 过夜，或37 ℃ 孵育1 h，入生物素化兔二抗（中山公司）孵育2 h，入ABC复合物（中山公司）孵育2 h，上述每步之间均经0．01 mol/L PBS溶液漂洗3次，每次10 min。DAB呈色，脱水透明、封片，光镜观察。阴性对照：用0．01 mol/L PBS代替一抗，其余步骤相同。免疫组化阳性细胞计数：nAchR阳性细胞为胞浆内呈棕黄色颗粒，与背景对比度明显。在显微镜下，记录阳性细胞数量，并拍照。
1．3 雌激素补充疗法[7]。
雌激素治疗组模型制作方法同穹隆海马伞切断组，其后应用雌二醇E2（1 mg/kg），每7 d 给予皮下注射1次，共30 d。观察补充外源性雌激素对nAchR的干预作用。
1．4 实验数据与统计处理。
在高倍镜下（400倍），海马CA1区和皮层区随机各取5个视野计数阳性细胞，平均计算单个视野中阳性细胞个数，用均数±标准差(±s)表示。各组数据间比较用计算机SPSS11．0软件做统计分析，然后两组数据间比较用t检验，P＜0．05为差别有显著统计学意义。