D—乳酸大肠杆菌工程菌的驯化及其补料发酵研究
摘要：以前期构建的D—乳酸大肠杆菌（Escherichia coli）工程菌LHY02为出发菌株，通过在乳酸盐中对菌株进行驯化的方式来解除乳酸根对菌体的抑制作用；采用葡萄糖分批补加方式缓解高含量葡萄糖的阻遏效应，拟进一步提高大肠杆菌发酵产D—乳酸的产量、生产强度和糖酸转化率。
结果表明，驯化后的菌株LHY201在16%的葡萄糖发酵中D—乳酸产量比驯化前提高了36.7%。
LHY201结合葡萄糖进行补料发酵（补料方式为8%+8%+4%），乳酸产量、发酵时间、糖酸转化率以及生产强度分别为185.7 g/L、48 h、93.8%、3.87 g/L/h，D—乳酸光学纯度达到99.6%，相比一次性添加20%葡萄糖的分批发酵，乳酸产量和糖酸转化率分别提高了21.1%和21.2%，发酵周期缩短了一半。
关键词：大肠杆菌工程菌；D—乳酸；驯化；补料发酵 中图分类号：Q533+.3 文献标识码：A 文章编号ki.issn0439—8114.2016.18.035 D—乳酸作为一种重要的手性中间体，是合成多种手性物质的前体，在医药、农药、化工及耐热型聚乳酸合成材料等方面的应用十分广泛，其生产具有重要的实用价值。
但相对于L—乳酸发酵生产而言，D—乳酸尚未实现大规模的生产和应用[1]。
目前已有一些菌株能较高产量生产D—乳酸，如芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp. CASD）经过发酵花生粕，D—乳酸产量高达207 g/L[2]；经过工程改造的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）能利用甘油产142.1 g/L的D—乳酸，原料转化率达到0.82 g/g[3]；同样经过工程改造的嗜碱芽孢杆菌产量可达143.99 g/L且生产强度可达3.04 g/L/h[4]；棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）配合同步糖化工艺发酵新鲜的甜土豆，产量达到186.40 g/L，生产强度保持在 2.55～3.11 g/L/h[5]。
大肠杆菌具有遗传背景清楚、营养要求低等优点，在D—乳酸发酵中也引起了越来越多学者的重视。
借助基因敲除手段配合两阶段发酵工艺，大肠杆菌Escherichia coli B0013—050B能产111.9 g/L高纯度的D—乳酸[6]；选用为Ca（OH）2为发酵中和剂，大肠杆菌Escherichia coli ALS974能产138 g/L 的D—乳酸，生产强度高达6.3 g/L/h[7]；而课题组前期构建的一株出发菌株为Escherichia coli W的工程菌Escherichia coli HBUT—D，在6 t的发酵规模下，采用中途一次补料的方式，能产126 g/L D—乳酸，生产强度高达6 g/L/h[1]。
总体来看，这些菌株发酵生产强度都较高，但大肠杆菌发酵D—乳酸的产量仍相对较低。
进一步提高大肠杆菌D—乳酸发酵产量，需更多的发酵原料，但微生物在发酵过程往往受到发酵原料中葡萄糖的阻遏及产物的抑制，继续提高发酵原料中的葡萄糖含量会造成发酵残糖过高，限制了D—乳酸产量的提升[1]；而且从前期的研究中还意识到，随着乳酸产物在发酵过程中的不断增加，产物乳酸根对发酵的抑制现象将会更明显[8]。
因此本研究拟以前期构建的工程菌Escherichia coli LHY02为研究出发菌株，通过在不同浓度的乳酸盐对菌株进行驯化，提高其对乳酸盐的耐受性，同时通过分批补料的发酵方式缓解高浓度葡萄糖的阻遏效应，最终达到进一步提高大肠杆菌D—乳酸的发酵产量、生产强度及糖酸转化率的目的。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株 试验所采用大肠杆菌E.coli LHY02（focA—pflB frdABCD adhE ackA：pflBp6—acEF—lpd）由本实验室构建，能高效利用葡萄糖或木糖发酵产D—乳酸，在无氧条件下生长良好，保存在—80 ℃甘油管中。
1.1.2 培养基 1）LB平板培养基（g/L）。
蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠5，琼脂20，121 ℃灭菌20 min。
参照文献[9]配置NBS培养基，按试验设计添加0～14%的乳酸钠和20 g/L的葡萄糖（单独灭菌，灭菌条件为115 ℃灭菌30 min）。
3）发酵种子培养基。
配置NBS培养基并灭菌，葡萄糖（20 g/L）单独灭菌后加入NBS培养基。
4）发酵培养基。
3 L NBS培养基，按试验需求分别添加一定量的葡萄糖。
1.2 方法 1.2.1 LHY02的耐乳酸盐驯化 将平板上生长良好的单菌落挑取4～6个接种至100 mL含有2%乳酸钠的驯化培养基中（培养基中加入20 mg左右已灭菌的CaCO3粉末），37 ℃、150 r/min条件下培养24 h后转代培养，每代测菌体生物量（OD600），当连续数代OD600值变化较小时，按2%的接种量转接至100 mL含4%乳酸钠的新鲜驯化培养基中，继续转代培养，依此类推，逐渐将乳酸钠添加量提高到12%，并在此浓度下反复驯化培养直至OD600值趋于平稳，对驯化后的菌株命名为LHY201。
1.2.2 驯化后菌株的分批发酵 驯化前的菌株LHY02和驯化后的菌株LHY201分批发酵的操作和条件为：挑选LB平板上活化好的4～6个单菌落接发酵种子培养基中，150 r/min、37 ℃培养至OD600达到1.2～1.5左右。
发酵条件为：150 r/min、37 ℃，通过流加4 mol/L Ca（OH）2控制发酵液pH为7。
定时取样，检测样品中菌体生物量（OD600值）、残留葡萄糖浓度、D—乳酸含量及其光学纯度、副产物琥珀酸和乙酸等杂酸的含量。
1.2.3 LHY201补料分批发酵 补料分批发酵时，发酵参数与分批发酵一致，差异为葡萄糖的补加方式。
采用两种葡萄糖补加方式：①发酵培养基初始葡萄糖浓度80 g/L，当葡萄糖浓度降至约10 g/L时，通过一次性补加高浓度的葡萄糖（800 g/L）； ②发酵过程中分两次补加葡萄糖。
发酵培养基基础葡萄糖（底糖）浓度为80 g/L，当葡萄糖浓度降至10 g/L左右时进行补加，第一次补加高浓度葡萄糖（800 g/L）；当葡萄糖浓度再次约降为10 g/L时补充至葡萄糖40 g/L。
定时取样，检测样品中菌体生物量（OD600值）、残留葡萄糖浓度、D—乳酸含量及其光学纯度、副产物琥珀酸和乙酸等杂酸的含量。
1.2.4 发酵液的检测 1）OD值的测定。
如发酵液中无Ca（OH）2，可直接用分光光度计测量600 nm条件下的吸光度；如发酵过程中使用了Ca（OH）2中和剂，可取1 mL发酵液用3 mol/L盐酸进行定量稀释后于600 nm处测吸光度（以同等稀释的盐酸为空白对照）。
葡萄糖浓度采用生物传感器进行检测。
取1 mL发酵液，离心5 min（4 000 r/min），上清液经去离子水稀释100倍后测定。
用 1 g/L的葡萄糖标样对传感器进行定标后即可测定。
取1 mL发酵液经过9 mL 2%的H2SO4处理，充分反应后经10 000 r/min离心10 min，上清液经0.22 m微滤膜过滤处理后，用液相色谱法测定乳酸及副产物乙酸和琥珀酸。
液相色谱条件依照文献[10]所描述的方法。
4）D—乳酸光学纯度的测定。
参照文献[10]中的检测方法检测L—乳酸和D—乳酸含量及光学纯度。
2 结果与分析 2.1 LHY02耐乳酸盐驯化的结果 大肠杆菌发酵D—乳酸的产量、转化率和生产强度往往受到如下几个方面的影响：①大多乳酸发酵过程中容易产生有机酸副产物（如乙酸、琥珀酸），影响了产量和光学纯度[11]；②在乳酸发酵中，代谢产物积累到一定浓度也会抑制菌体的生长，表明乳酸根是抑制菌体生长的主要代谢产物，当乳酸达到一定浓度时，就对菌体生长产生抑制作用[12]。
为了解决大肠杆菌发酵D—乳酸中面临的这些问题，研究者们从菌种的构建和驯化等方面着手研究，并取得了一定的成效。
由于大肠杆菌遗传背景清晰，因此借助于基因敲除技术，阻断杂酸代谢途径，使主产物D—乳酸的产量有了较大的提升，同时还大大提高了D—乳酸产物的化学纯度及光学纯度，目前已成功构建一批大肠杆菌工程菌用于D—乳酸的发酵[6，7，13]。
本实验室前期以大肠杆菌B为出发菌株，通过染色体基因敲除技术结合无氧启动子融合表达技术，使菌株能够在微氧条件下良好生长，从而能促进乳酸产量提高。
但是，从前期的研究中意识到，随着乳酸产物在发酵过程中的不断增加，产物乳酸根对发酵的抑制现象将会更明显[11]。
面对这个问题，首先采用了驯化手段来进一步提高大肠杆菌工程菌对乳酸的发酵能力。
驯化是提高微生物对不良环境因子耐受性的一种重要手段，已有研究表明，产乳酸菌经过驯化，菌株对产物乳酸的耐受性显著提高，经过驯化的菌株生物量提升了18%[14]。
因此在大肠杆菌传代时，逐步提高乳酸钠的含量，来改善大肠杆菌LHY02对乳酸根的耐受性。
从表1的结果来看，经过22代驯化后得到的菌株LHY201，其在12%乳酸盐条件下培养所得OD600 nm为0.37，较驯化前数值有较大的降低。
但相对一些在乳酸根含量超过10%就完全不能生长的产乳酸的菌株[15]，LHY201仍表现出较好的生长性能。
2.2 驯化后菌株分批发酵产D—乳酸的效果 为了进一步考察乳酸根对菌株的驯化效果，以驯化前的菌株LHY02为对照，考察了LHY201在含16%高浓度葡萄糖的发酵培养基中的发酵效果。
发酵罐中菌体生长情况见图1。
由图1可知，菌株LHY02和LHY201最大OD600 nm分别达到2.84和5.04。
经过驯化，菌体OD600 nm提高了77.5%，表明驯化后菌株LHY201在发酵时拥有较好的生长性能。
驯化后的生物量提高，会反映到产物生成和底物的消耗上。
从图1可以发现，发酵到56 h， LHY201乳酸产量达到138.1 g/L，相对于出发菌株LHY02产量（101.0 g/L）提高了36.7%。
同时葡萄糖的消耗也随之增加，残糖量也有所降低，驯化前菌株发酵残糖为51.2 g/L，驯化后的菌株发酵时残糖降为13.3 g/L。
为了进一步验证LHY201的发酵性能，对其在不同浓度的葡萄糖（8%、16%、20%）条件下进行了分批发酵（表2）。
LHY201利用8%的葡萄糖进行发酵，糖酸转化率达98.3%，发酵在26 h结束，未检测到残糖。
初糖浓度提高到16%时，由于添加Ca（OH）2的原因，发酵液终体积达到3.51 L，测得乳酸118.0 g/L，按稀释率换算乳酸产量138.1 g/L；葡萄糖浓度进一步提高到20%时，发酵液体积达到3.62 L，测得乳酸为127.0 g/L，按稀释率最终换算得乳酸产量为153.3 g/L。
相比8%的初糖，葡萄糖提高到16%和20%时，乳酸产量明显增加，但是糖酸转化率有所下降，分别为86.4%和77.4%，发酵周期长且均有一定量的残糖产生。
2.3 驯化后的菌株LHY201的补料分批发酵产D—乳酸 进一步提高大肠杆菌D—乳酸发酵产量，需要高浓度的葡萄糖原料，但是，发酵过程中，高浓度的葡萄糖会产生阻遏效应，使菌体无法利用碳源而导致发酵停滞[16]。
同时，高浓度的葡萄糖会导致发酵液渗透压过高而影响菌体生长，如在培养基中一次性添加10%的葡萄糖，就发现菌体的生长和乳酸发酵能力受到明显地抑制[9]。
补料发酵能部分解除葡萄糖阻遏效应，更是一种常用的提高微生物发酵产量及生产强度的手段[17]。
目前D—乳酸发酵产量较高的报道中，几乎都采用了补料发酵的办法。
如芽孢乳杆菌Sporolactobacillus sp. CASD经过发酵花生粕，D—乳酸产量高达207 g/L[2]，研究者探索了多次补料和单次补料产D—乳酸效果，发现发酵过程中多次补料相对于单次补料，D—乳酸产量和生产强度较高而糖酸转化率较低；同样经过工程改造的嗜碱芽孢杆菌发酵D—乳酸时，其主要补料方式为加入8%的葡萄糖作为底糖，然后当发酵液残糖低于20 g/L时流加高浓度的葡萄糖，产量可达143.99 g/L且生产强度可达3.04 g/L/h[4]。
课题组前期构建的大肠杆菌工程菌在6 t的发酵规模下，采用中途一次补料的方式（8%的葡萄糖作为底糖，补加5%的葡萄糖），能产126 g/L D—乳酸，生产强度高达6 g/L/h[1]。
在驯化菌株的基础上，尝试用补料分批发酵的方法来进一步提高乳酸产量和糖酸转化率，并对分批发酵及补料分批发酵进行了对比。
补料发酵中采用较低的初糖浓度（80 g/L），菌体能很快适应环境，提前进入产酸期；发酵液中残糖浓度下降至10 g/L左右时进行补加葡萄糖。
具体补加葡萄糖方式为：8%+8%和8%+8%+4%。
采用8%+8%的葡萄糖添加方式进行发酵（图2），发酵到24 h还剩残糖8.21 g/L，此时补加葡萄糖80 g/L。
发酵到38 h葡萄糖完全耗尽，最终发酵液体积达3.97 L，此时测得乳酸产量为115.3 g/L，折算稀释率，换算得乳酸最终产量为152.6 g/L，糖酸转化率达95.4%，生产强度4.02 g/L/h。
从图2中还可以看到发酵副产物琥珀酸和乙酸分别为1.49 g/L、3.06 g/L，含量相对较小。
采用8%+8%+4%的葡萄糖添加方式（图3），分两次补加葡萄糖，整个发酵过程历时48 h，糖酸转化率为93.8%，导致的发酵液最终体积达到4.35 L，测得乳酸产量为128.1 g/L，根据稀释率换算得乳酸最终产量为185.7 g/L。
发酵副产物乙酸和琥珀酸分别为5.41 g/L和3.76 g/L。
从表3可以看出，相比分批发酵，补料分批发酵缩短了发酵时间，发酵结束后未检测到残糖。
采用补料方式为8%+8%进行葡萄糖补料发酵，发酵38 h，产乳酸152.6 g/L，相比一次性添加16%的葡萄糖，乳酸产量提高了10.5%，发酵周期缩短了18 h，糖酸转化率增加了10.4%。
采用补料方式为8%+8%+4%进行葡萄糖补料发酵，乳酸产量为185.7 g/L，相比一次性添加20%葡萄糖的分批发酵，乳酸产量提高了21.1%，发酵周期缩短了一半，糖酸转化率增加了21.2%。
可见，通过补料发酵不但D—乳酸发酵产量提高，还可解决分批发酵中残糖多及糖酸转化率不高的问题。
3 小结 经过高含量（12%）乳酸钠的驯化，可获得对乳酸盐有较好耐性的菌株（LHY201），其生物量相对于出发菌株（LHY02）提高了77.5%。
作为生长与产物合成同步的发酵类型，驯化菌株LHY201表现出了较好产D—乳酸性能。
利用16%葡萄糖进行分批发酵时，乳酸产量达到138.1 g/L，相对于出发菌株LHY02产量提高了36.7%。
相比分批发酵，补料分批发酵大大缩短了发酵时间，且D—乳酸发酵产量、生产强度及糖酸转化率都相应提高。
采用补料方式为8%+8%进行葡萄糖补料发酵，发酵38 h，产乳酸152.6 g/L，相比一次性添加16%的葡萄糖，乳酸产量提高了10.5%，发酵周期缩短了18 h，糖酸转化率增加了10.4%。
采用补料方式为8%+8%+4%进行葡萄糖补料发酵，乳酸产量为185.7 g/L，相比一次性添加20%葡萄糖的分批发酵，乳酸产量提高了21.1%，发酵周期缩短了一半，糖酸转化率增加了21.2%。
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