从四种生物原料中制备高纯度I型胶原的比较
作者：保毅, 胡蕴玉,毕龙, 孟国林,李丹,白雪东,刘民。
【摘要】 ［目的］比较从4种生物原料中制备高纯度I型胶原，以满足骨组织工程应用的需要。［方法］分别以牛皮质骨、牛跟腱、猪跟腱和猪皮为原料，采用酸性条件下胃蛋白酶限制性酶解法提取I型胶原，并用紫外吸光度、氨基酸分析、SDS—PAGE电泳进行鉴定，计算提取率、纯度，同时与Sigma公司产品进行比较。［结果］本法所提胶原的最大紫外光吸收波长为230nm，氨基酸分析、电泳鉴定符合I型胶原特征。牛皮质骨所提胶原纯度最高(96.12％)，优于Sigma公司产品，而牛腱胶原提取率最高(75.34％)，超过常规方法。［结论］限制性酶解法可以从4种生物原料中制备高纯度、高提取率的I型胶原产品，其中以牛皮质骨胶原最好，具有良好的应用前景。
【关键词】 I型胶原; 组织工程; 制备; 限制性酶解法。
［Method］Bovine cortical bone, bovine achilles tendon, porcine achilles tendon and porcine skin were splitted into pieces of 0.2—0.5 mm. After being immersed in glacial acetic acid, they were extracted with pepsin. Then the crude products were dissolved, centrifuged, dialyzed and freeze drying to prepare pure collagen type I. The final products were confirmed by absorbance, amino acid analysis and‘SDS—PAGE electrophoresis comparing them with the products of Sigma Company.
［Result］The wave length of maximum absorbance of the final products was 230 nm, and the amino acid analysis and SDS—PAGE electrophoresis confirmed that the final products were collagen type I. The purity of product extracted from bovine cortical bone was the highest (96.12%) and higher than that from Sigma Company. The extraction rate of bovine achilles tendon collagen was the highest (75.34%).
［Conclusion］Collagen type I of higher purity and higher extraction rate can be prepared using a limited enzyme digestion method.And the product from bovine cortical bone is better than the others,which has a promising prospect.
Key words：collagen type I; tissue engineering ; preparation ; limited enzymedigestion method。
I型胶原是骨基质中的主要有机成分。随着骨组织工程技术的应用和发展，胶原在促进细胞粘附和材料表面修饰方面的优势日益突出［1］。据报道，每年因肿瘤、创伤等各种原因所致需要骨移植的患者超过三千万［2］。由于生物骨材料存在来源有限和免疫原性等诸多限制，需要上百万的人工骨移植产品来满足缺口，而其中大部分产品都用胶原作为原料，由此可见，I型胶原的研究和开发具有巨大的经济价值和社会效益。由于I型胶原的特殊结构，常规化学方法提取效果差、纯度低，难以满足实际需要。本文作者采取酸性条件下胃蛋白酶限制性酶解法，比较从4种生物原料(牛皮质骨、牛跟腱、猪跟腱、猪皮)中制备I型胶原，并与Sigma公司I型胶原样品在生物特性等方面进行了比较。
1材料与方法。
1.1 主要试剂和仪器。
胃蛋白酶(Amersco公司)、甲醇、氯仿、冰醋酸、NaHCO3、盐酸、NaCI、NaOH (购自西安化学试剂厂)、 I型胶原(Sigma C9879)液氮、氨基酸分析仪(日立L—8800)、紫外分光光度仪(日立U—2001)、电泳仪(Bio—Rad)，高速离心机(BeckmanJ25)、冷冻干燥机(ALPHAl—2LD plus)、深低温冰箱(REVCO)、硬组织粉碎机(上海飞龙仪表电器有限公司)、透析膜、次高分子量标准蛋白质(中科院上海生化所)。
1.2 胶原原料准备。
取新鲜牛皮质骨、牛跟腱、猪跟腱、猪皮作为原料。牛皮质骨去除软组织、骨膜、松质骨及骨髓，粉碎机粉碎至0.2～0.5 mm大小骨粉，粉碎过程中加入液氮保持温度在4 ℃以下。取10g骨粉双蒸水洗涤，去除杂质，氯仿、甲醇（1∶1）脱脂4h,双蒸水洗涤3次，0.6 mol/L盐酸脱钙48h，双蒸水洗涤3次。牛跟腱、猪跟腱、猪皮去除软组织、脂肪后分别称取10 g，粉碎机粉碎至0.2～0.5 mm大小组织块，后经NaCI浸泡5 min，NaHCO3浸泡30 min，氯仿、甲醇(1∶1)脱脂4 h，双蒸水洗涤3次。
将骨粉浸于1 mol/L醋酸，按100∶1(骨粉：胃蛋白酶，w／w)比例加入胃蛋白酶抽提，同时将牛跟腱、猪跟腱、猪皮浸于1 mol/L醋酸，按10∶1(w／w)比例加入胃蛋白酶抽提［3］。共抽提3 d，抽提过程在4℃下进行，连续搅拌。抽提后液体，10 000 g离心10 min，去除沉淀，所得上清为胶原粗提液；粗提液中加入NaCI至浓度为10％，即有大量白色沉淀析出，静置30 min；15 000 g离心15 min，弃上清，沉淀为粗提胶原；粗提胶原复溶到0.5 mol/L醋酸中，过滤去除不溶杂质，10倍体积双蒸水半透膜透析24 h，每8 h换水1次；透析后所得即为精制胶原液，冻干机冻干保存。
1.4 胶原鉴定。
1.4.1 紫外分光光度计检测胶原吸收峰。
取以上4种胶原0.5％溶液，采用日立U—2001型紫外分光光度仪在200 nm～450 nm波长范围内，以10 nm的间距进行扫描，测定样品最大紫外吸收峰的波长。
取以上4种胶原样品0.3 g经6 mol/L盐酸水解为游离氨基酸，经日立L—8800氨基酸分析仪离子交换色谱柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色，测定氨基酸含量。所得结果同I型胶原样品(Sigma公司)进行比对分析。
1.4.3 SDS—PAGE电泳检测胶原蛋白分子量。
把以上4种胶原配制浓度为1 μg/μl的样品溶液，进行SDS—PAGE电泳。每次上样量15 μl，以次高分子量标准蛋白为Marker，用5％的浓缩胶，8％的分离胶，电压分别为浓缩胶80 V，分离胶140 V，电泳120 min。
1.5.1 提取率测定。
每次取4种生物原料(牛皮质骨、牛跟腱、猪跟腱、猪皮)各10 g进行胶原提取，测定每次冻干后纯化胶原的质量，重复5次，并通过以下公式计算胶原提取率。
胶原提取率：5次纯化胶原质量之和 5次生物原料质量之和×100%。
1.5.2 羟脯氨酸含量测定（Woressner法［4］）。
标准曲线绘制：称取羟脯氨酸标准品，溶于0.001 mol/L盐酸，按比例稀释成梯度溶液：12.5、25、50、75、100 mg／ml。取2 ml梯度溶液加入1.4％氯胺T溶液1 ml混合，室温下静置20 min，加入18.9％过氯酸溶液1 ml，室温下静置5 min，加入20％对二甲基苯甲醛溶液1 ml，60 ℃加热20 min，冷却后，测定560 nm处吸光度。统计学软件SPSS 10.0分析浓度和吸光度间关系，计算相关公式、相关系数并拟和标准曲线。
取以上4种胶原各0.40 g与6 mol/L盐酸按1∶100(w／v)混合，110 ℃加热水解24 h，水解后除去盐酸，残渣溶于双蒸水制成样品液。重复上述处理测定560 nm吸光度，并根据公式计算样品中羟脯氨酸含量。
1.5.3 纯度计算。
1.6 胶原比较。
将本实验所制备4种胶原和I型胶原样品(Sigma公司)进行蛋白含量、胶原纯度的比较。
2 结 果。
2.1 紫外分光光度计检测胶原吸收峰。
经测定4种胶原最大紫外光吸收波长均在230 nm，形成一个较陡峭的峰，符合胶原蛋白特殊吸收峰波长位置，与文献报道的I型胶原特征相符［6］。