黄芪激活ERK1/2信号转导通路抗心肌细胞再灌注损伤作用
作者：宋光，何蕾,王彬,江朝光。
【摘要】 目的 研究黄芪注射液调节ERK1/2信号转导通路抗培养乳鼠心肌细胞再灌注损伤的作用。方法 采用培养的SD乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型，实验分为五组：A组为正常对照组，B、C、D、E组均为缺氧／复氧组，其中各组培养液组成为：B组缺氧液，C组缺氧液加黄芪，D组缺氧液加PD98059，E组缺氧液加黄芪和PD98059。缺氧4h，复氧2 h。比较缺氧/复氧前后培养液中心肌酶含量，并进行心肌细胞外信号调节激酶(ERK)蛋白表达检测。结果 缺氧/复氧后对各组细胞培养液中心肌酶含量进行比较，结果显示各缺氧组与正常对照组比较，心肌谷草转氨酶(GOT)，乳酸脱氢酶(LDH)，肌酸激酶(CK)均有升高（P＜0.05）。黄芪缺氧组与缺氧对照组比较，GOT升高减轻（P＜0.05）。ERK抑制剂PD98059对黄芪的保护作用有一定削弱，但没有统计学意义。黄芪可使缺氧/复氧引起的心肌细胞ERK表达增加， PD98059对黄芪引起的ERK表达增加没有明显抑制作用。结论 黄芪能够减轻缺血再灌注损伤，其机制涉及了ERK1/2信号途径。
Abstract: OBJECTIVE To evaluate the protective effect of astragalus injection through activation of ERK1/2 pathway in cultured cardiac myocytes. METHODS Studies were conducted on cultured cells. Rat ventricular myocytes were subjected to hypoxia 4h and reoxygenation 2h. Astragalus injection was applied to cells during ischaemia/reoxygenation, myocardial enzyme was determined and ERK1/2 expression was detected by Western blot after 120 minutes of reperfusion. RESULTS In cardiac myocytes, incubation with astragalus during ischaemia/reoxygenation attenuated the extent of cell damage. Protective effect of astragalus injection was decreased by PD98059, an inhibitor of ERK1/2 activation,but had no statistical significants. Astragalus activated ERK1/2 in ischaemia/reoxygenation myocytes. CONCLUSION This studiy shows that astraglus attenuates cardiac myocytes injury during reperfusion and the mechanism involves ERK1/2 activation.
Key words： Astragalus; Cardioprotection; ERK pathway; Cell hypoxia.
黄芪这种古老的中药具有明确的抗再灌注损伤作用，其机制可能与扩张冠状动脉，改善心肌血供等多方面有关。但黄芪是否通过参与某些信号途径，从而调动了正向的保护机制少有研究。文献报道促分裂原活化蛋白激酶(mitogen—activated protein kinase, MAPK)在体内体外的心肌组织缺血再灌注损伤实验中都能激活。本文旨在研究黄芪抗再灌注损伤作用与MAPK家族中心肌细胞外信号调节激酶(extracellular signal—regulated kinase, ERK)1/2信号通路活化的关系，探讨黄芪的心肌保护作用机制。
1 材料和方法。
1.1 原代心肌细胞培养 取材自同窝出生1～3 日龄Sprague Dawley大鼠（由解放军总医院实验动物中心提供）心室组织，原代心肌细胞接种于培养瓶内，纱巾法培养。37℃，5%CO2饱和湿度培养箱（REVCO公司，美国）内培养24h使细胞贴壁生长。经鉴定90％以上为心肌细胞，90％以上为活细胞即可用于实验［1］。
1.2 缺氧/复氧心肌细胞模型制备 原代培养心肌细胞于实验前更换含1%胎牛血清DMEM培养液培养24h。缺氧实验开始时更换缺氧缓冲液。缺氧缓冲液（NaCl 137 mM,KCl 12 mM,MgCl2 0.49 mM,CaCl2 0.9 mM,HEPES 4 mM,deoxyglucose10 mM,sodium lactate 20 mM,pH 6.2）［2］为高钾低pH溶液，用以模拟心脏细胞暴露于无氧条件。其后将细胞置于配气（95%N2+5%CO2，北京普莱特斯公司）饱和的容器中，放入孵箱，37℃培养4 h。4 h后恢复有氧环境，倾去缺氧缓冲液，换正常10％血清极限必需培养基(DMEM)后将细胞置于5%CO2孵箱中，于复氧条件下继续培养2 h，造成心肌细胞缺氧复氧损伤。
1.3 实验分组及实验方法 培养的乳鼠心肌细胞随机分为5组。A组正常对照组，不加入黄芪，也不进行缺氧复氧处理。B组，C组，D组，E组均为缺氧／复氧组，其中各组培养液组成为：B组缺氧液，C组缺氧液加黄芪，D组缺氧液加ERK抑制剂PD98059（Promega公司，美国），E组缺氧液加黄芪和PD98059，黄芪终浓度为200μl黄芪/ml培养液，PD98059终浓度5 μΜ［2］。实验开始时A实验组更换10%胎牛血清DMEM培养液入培养箱培养6 h。缺氧／复氧各组更换相应缺氧培养液，缺氧培养4h，随后更换相应复氧培养液培养2 h。实验结束时取各组培养液0.5 ml在全自动生化分析仪上测定心肌酶含量，并将各组细胞提取蛋白进行检测。
1.4 Western Blot免疫印迹检测ERK蛋白表达 实验结束后收集心肌细胞并裂解，采用Bradford考马斯亮蓝法，通过测量595 nm处的吸光度值，进行蛋白质定量。随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，积层胶浓度5%，分离胶浓度10%，电泳在Tris—甘氨酸缓冲液中进行，所用电压为： 积层胶 120 V，分离胶140 V。电泳结束后硝酸纤维素膜电转移2 h， 电流0.65mA/cm2。转膜完成后10％的脱脂奶粉37℃封闭硝酸纤维素膜1h，加入1∶300小鼠抗ERK抗体（Santa Cruz，美国）孵育，4℃过夜。磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后加入1∶1000HRP标记羊抗小鼠二抗（中杉金桥生物技术公司，北京），37℃孵育1 h。PBS漂洗后发光试剂显色，曝光，冲洗，扫描成像。图像经凝胶图像分析系统分析。
1.5 统计方法 采用SAS软件v8.2版本进行统计学分析。数据用均数±标准差(±s )表示，组间两两比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果。
2.1 缺氧/复氧心肌细胞培养液中心肌酶的变化 缺氧/复氧后对各组细胞培养液中心肌酶含量进行比较，结果显示各缺氧组与正常对照组比较，心肌谷草转氨酶(GOT)，乳酸脱氢酶(LDH)，肌酸激酶(CK)均有升高，P＜0.05。而黄芪缺氧组与缺氧对照组比较，GOT升高减轻，P＜0.05；LDH和CK升高也减轻，但没有统计学意义。说明加入黄芪后心肌细胞的再灌注损伤有所减轻。其余组两两之间比较没有明显差异。ERK抑制剂PD98059对黄芪的保护作用有一定削弱，但没有统计学意义，见表1。表1 缺氧/复氧心肌细胞培养液中心肌酶的变化注：*与B组比较，P＜0.05。
2.2 缺氧/复氧心肌细胞ERK蛋白表达的变化 正常组心肌细胞有一定量ERK表达（A组），在缺氧/复氧后心肌细胞ERK表达增加（B组），黄芪加缺氧的双重刺激使ERK表达增加更明显（C组），加入ERK抑制剂PD98059后其表达明显减少（D组），而黄芪＋PD98059组ERK表达无明显减少（E组）。见图1。图1 缺氧/复氧心肌细胞ERK蛋白表达的变化注：1：A组；2：B组；3：C组；4：D组；5：E组。