乙酰肝素酶在子痫前期孕妇胎盘中的表达的方式分析
[摘要] 目的 探讨乙酰肝素酶在子痫前期孕妇胎盘中的表达及其与病情轻重的关系。 方法 选取患者共43例，分为正常对照组13例，子痫前期轻度组15例，子痫前期重度组15例，采用Western—blot检测孕妇新鲜胎盘组织中乙酰肝素酶的表达情况。 结果 在3组标本中均有Hpa蛋白表达，子痫前期轻度及重度组明显高于正常对照组（P 0.001），且子痫前期重度组与轻度组比较差异有统计学意义（P 0.001）。 结论 子痫前期孕妇胎盘中Hpa的含量明显高于正常对照组，且随病情加重而愈加显著。 [关键词] 乙酰肝素酶；子痫前期；胎盘；表达 [中图分类号] R714.24+5 [文献标识码] A [文章编号] 1674—4721（2012）10（c）—0016—03 妊娠期高血压疾病子痫前期是影响孕产妇及围生儿发病率及死亡率的严重产科并发症，其病因及发病机制较为复杂，目前，关于其病因学方面的研究有多种理论，如内皮细胞损伤、功能障碍、结构损伤、滋养细胞过度凋亡、免疫炎症反应等。近年来经过专家学者的研究发现，子痫前期重度孕妇血液中的肝素水平下降为正常孕妇的50%[1]，血液呈高凝状态，临床采用肝素抗凝治疗取得了较明显的效果。1999年，以色列科学家Vlodavsky I等[2]从胎盘中成功克隆纯化出一种名为乙酰肝素酶（heparanase，Hpa）的物质，之后，对其研究深入开展。那么Hpa与孕妇肝素水平下降[1]及血管内皮损伤又有怎样的关系呢？本实验就是围绕这个问题而开展的。 Hpa是目前发现的能够降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和基底膜（basement membrane，BM）主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteogly can，HSPGs）和侧链肝素（heparan sulfate，HS）及其衍生物的酶[3]，它广泛存在于胎盘滋养细胞、血小板、巨噬细胞、活化的T、B淋巴细胞和癌细胞等多种细胞中，通过水解其底物来参与一系列的生理和病理过程，如胚胎发育、形态发生、血管形成及组织修复、炎症、自身免疫、肿瘤生长和转移等。产科领域，在胚泡植入、胎盘形成、分娩发动及产科并发症中均有较为重要的作用。Hpa在胎盘中的定位怎样？它在正常孕妇、子痫前期轻度及子痫前期重度孕妇胎盘中的蛋白含量是否有显著性差异？能否反映病情轻重？本实验用Western—blot来明确Hpa在子痫前期孕妇与正常妊娠孕妇胎盘中的定位情况及其蛋白表达水平与病情轻重的关系。 1 材料与方法 1.1 标本来源 取辽宁大连妇产医院2010年10月～2011年10月住院患者胎盘组织43例，分为3组，其中，正常对照组13例，子痫前期轻度15例，子痫前期重度15例。3组在年龄、孕周、孕产次、体重、身高等方面差异无统计学意义（P 0.05）。无妊娠期糖尿病、感染性疾病、肝、肾病和原发性高血压等疾病，且未用过与此实验相关的药物治疗。子痫前期患者的诊断标准以第七版《妇产科学》为依据。所取组织为脐带根部胎盘全层1 cm3 。受试者资料详见表1。 总结大全 /html/zongjie/ 1.2 一般组织学处理 用于Western blot分析的新鲜组织，于术中切除后，立即于—80℃冰箱保存备用。 1.3 主要试剂与方法 Western—blot肝素酶一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG二抗和NBT/BCIP染色试剂盒购自武汉博士得生物有限公司。取新鲜胎盘组织全层1 cm3，加入裂解缓冲液，剪碎，匀浆，低温超速离心（4℃，13 000 r/min，30 min），提取上清液为细胞总蛋白，电泳（10% SDS—PAGE凝胶），转印，5%正常小牛血清封闭，一抗（1∶500）4℃下孵育，过夜；与二抗室温下孵育1 h，NBT/BCIP显色30 min，水洗干燥，避光保存，测定灰度值比较结果。 1.4 统计学方法 应用SPSS 12.0软件进行统计学处理；乙酰肝素酶蛋白相对含量比较采用t检验，P 0.05为差异有统计学意义。 2 结果 3组标本均有Hpa蛋白表达。子痫前期轻度及重度组蛋白含量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P 0.001），且子痫前期重度组与轻度组结果比较，差异有统计学意义（P 0.001），见表2、图1。 3 讨论 Hpa是一种能够降解ECM和BM的主要组成成分HSPGs、侧链乙酰肝素盐及体内肝素的内源性葡萄糖醛酸内切酶，当其发挥生物学效应时可以破坏内皮细胞的完整性及加重子痫前期孕妇血液的高凝状态[1]，并以此为契机引发体内一系列的病理生理活动。早在1976年Klein U等[4]科研小组就发现了Hpa这种能够裂解ECM和BM中HSPGs、其侧链乙酰肝素盐及肝素的葡萄糖醛酸内切酶，但因纯化过程较为困难，使其发展一度较为缓慢。直到1999年，3个研究小组分别从血小板、胎盘和黑色素细胞瘤中克隆出一段相同的基因，提示目前发现哺乳动物细胞只表达一种能够降解肝素的酶即Hpa[5—6]。1999年，以色列科学家Vlodavsky I等[2]成功纯化出Hpa蛋白并克隆出其基因，将人类Hpa基因定位于4q21.3，其相对分子量约为65 000，降解后分子量为50 000的蛋白片段具有活性。 开题报告 /html/lunwenzhidao/kaitibaogao/ Hpa能够破坏血管内皮细胞。细胞膜和基底膜主要构成成分之一是糖氨聚糖，它的主要成分是HSPGs。HSPGs是一个由蛋白核心和数个与之共价连接的线性硫酸乙酰肝素侧链组成[7—8]，对于细胞的完整性有至关重要的作用，Hpa通过酶解HSPGs及其侧链[9]，可以破坏ECM和BM的完整性，同时，还可以释放并激活各种与肝素结合的活性分子破坏血管内皮完整性，使血管内皮细胞就会出现功能障碍，同时内皮受损会释放出大量的炎症介质以及介导免疫反应的活性蛋白片段，使血管内皮源性舒张因子减少，而血管内皮收缩因子血栓素A2产生增加，导致血管收缩因子和舒张因子比例失调，致血压升高[9]。同时Hpa裂解HSPGs所产生的一系列活性蛋白片断和其裂解肝素及其衍生物所致的血液高凝状态，使微小血栓形成，血管阻力增高，血压升高；同时血栓形成，血运不畅，形成酸性环境，进一步激活Hpa活性，形成恶性循环。本实验结果可见，Hpa在子痫前期轻度及重度孕妇胎盘中的蛋白表达明显高于正常对照组，而子痫前期重度孕妇胎盘中的Hpa蛋白表达又明显高于子痫前期轻度，这与血压升高趋势相同，由此推测，Hpa与子痫前期患者血压升高可能具有相关性。 Hpa破坏肝素与抗凝血酶Ⅲ的结合位点，阻碍肝素发挥抗凝作用[10]，致血液处于高凝状态[11]。在以往研究发现，先兆子痫患者血清中基础肝素水平及抗凝活性比正常孕妇下降50%[1]，这与本实验Hpa的变化趋势是一致的。子痫前期的孕妇，血压升高。
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