幽门螺杆菌感染对胃黏膜上皮细胞端粒酶活性的影响及其与细胞凋亡
作者：王国安 刘海峰 房殿春 陈刚 何俊堂 腾小春。
【摘要】 目的 探讨幽门螺杆菌(Hp)感染对端粒酶活性的影响及其与细胞凋亡的关系。方法 慢性胃炎伴萎缩者16例，伴肠化生者15例，伴中、重度不典型增生者14例，胃癌19例共64例为研究对象。采用快速尿素酶试验、WarthinStarry银染色检测幽门螺杆菌，采用SP法检测人端粒酶催化亚单位(hTERT)蛋白表达，采用TUNEL染色法原位检测细胞凋亡。结果 (1)萎缩性胃炎、肠化生、不典型增生和胃癌组织中hTERT蛋白表达率分别为25.00%、46.67%、 64.29%和78.95%，呈递增趋势。Hp阳性患者hTERT蛋白表达率为77.42%，显著高于Hp阴性患者(33.33%，P0.01)。(2)Hp阳性伴hTERT蛋白阳性患者细胞凋亡指数为9.57±5.01，显著高于Hp阴性伴hTERT蛋白阳性患者(6.01±5.31，P0.05)。结论 (1)端粒酶激活可能参与了胃黏膜上皮细胞恶性转化的全过程。Hp感染与端粒酶活性密切相关。Hp感染可能是激活端粒酶的重要机制之一。(2)Hp感染既可激活端粒酶，引发细胞永生化，又可以诱导胃黏膜上皮细胞凋亡，进而增加了胃黏膜的不稳定性和癌变的危险性，这可能是Hp致癌的主要机制之一。
【Abstract】 Objective To investigate the influence of H.pylor infection on hTERT expression and its relationship with cellular apoptosis. Methods H.pylori was detected by urease test and WarthinStarry method. Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated deoxyuridine triphosphate biotin nick end labeling (TUNEL) technique and immunohistochemistry were used to detect the apoptotic cells and the expression of human telomerase catalytic subunit (hTERT) in 64 specimens including 16 chronic atrophic gastritis, 15 intestinal metaplasia, 14 gastric dysplasia and 19 human gastric carcinoma. Results (1) The positive rate of hTERT protein expression in chronic atrophic gastritis, intestinal metaplasia, gastric dysplasia and human gastric carcinoma was 25.00%, 46.67%, 64.29% and 78.95%, which took on a increasing tendency. The positive rate of hTERT in the cases with H.pylori infection was significantly higher than that in the cases without H.pylori infection (77.4% vs 33.33%, P0.01). (2)The apoptotic index in the cases with hTERT protein expression and H.pylori infection was 9.57±5.01, which was significantly higher than that in the cases with hTERT protein expression but without H.pylori infection (6.01±5.31, P0.05). Conclusions(1) The activity of telomerase may take part in all of the process of gastric carcinogenesis. (2) H.pylori infection can not only activate telomerase but also increase the apoptosis of gastric epithelioid cells, which increases the instability of gastric epithelioid cells and the risk of gastric cancinogenesis.
【Key words】 Gastric carcinoma; H.pylori; Telomerase; Cell apoptosis。
端粒酶的激活在肿瘤发生中起关键作用［1］。端粒酶活化与细胞凋亡的关系是目前肿瘤研究的热点之一。探讨Hp感染对胃黏膜上皮细胞端粒酶活性的影响及其与细胞凋亡的关系， 是研究Hp致癌机制的一个重要方向。本研究旨在对胃癌演变过程中Hp感染，端粒酶激活及细胞凋亡之间的关系进行初步探讨。
1 材料与方法。
1.1 材料。
随机抽取我院2000—2002年胃镜活检标本和胃癌手术切除标本64例。其中慢性胃炎伴萎缩者16例，伴肠化生者15例，伴中、重度不典型增生者14例，胃癌 19例均为胃远端癌。胃癌患者在手术前均未接受化疗、放疗或免疫治疗。胃镜活检标本均取自胃窦部，组织标本经福尔马林固定，石蜡包埋，4 μｍ厚连续切片，并经苏木精伊红染色病理诊断证实。兔抗人hTERT多克隆抗体、SP免疫染色试剂盒均购自SantaCruz公司。
1.2 方法。
1.2.1 Hp检测 采用快速尿素酶法和WarthinStarry银染色法，两种方法均阳性者判为Hp感染，两种方法均阴性者判为Hp阴性，单项阳性者退出试验。
1.2.2 人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit,hTERT)蛋白检测 采用链霉菌素生物素过氧化物酶(SP)染色法。染色程序按SP法操作常规进行，第一抗体原液按1∶100稀释。以已知hTERT蛋白阳性的胃癌为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。光镜下观察免疫组化染色切片的显色反应,计数500个细胞中的阳性细胞数,hTERT蛋白表达阳性细胞数10％判为阴性(—)，10％～25％判为弱阳性(+),26％～50％判为中等阳性(),≥51％判为强阳性()。
1.2.3 凋亡细胞的原位检测 采用TUNEL技术原位检测凋亡细胞。细胞凋亡原位检测试剂盒为德国Roche公司产品。染色步骤如下：(1)切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；(2)3%过氧化氢封闭15 min；(3)蒸馏水冲洗，PBS振洗3次，每次5 min；(4)0.5%胰蛋白酶消化20 min；(5)PBS振洗3次，每次5 min；(6)滴加TUNEL反应液，37 ℃孵育60 min；(7)PBS振洗3次，每次5 min；(8)滴加过氧化物酶连接的抗荧光素抗体，37 ℃孵育30 min；(9)PBS振洗3次，每次5 min；(10)DAB显色3～5 min；(11)自来水充分冲洗，苏木精复染1 min；(12)自来水充分冲洗，过蒸馏水，梯度酒精常规脱水、二甲苯透明；(13)中性树胶封片。
以已知TUNEL阳性胃癌切片作为阳性对照，以PBS代替TUNEL反应液作为阴性对照。阳性对照切片经DNaseⅠ预处理10 min，再接TUNEL染色步骤。光镜下观察TUNEL染色切片的显色反应，选择5个以上有代表性的视野，计数500个细胞中的阳性细胞数，即凋亡细胞指数，用百分数表示。
1.3 统计学处理。
数据以±s表示，χ2检验，采用SPSS10.0统计程序包进行分析，P0.05为差异有统计学意义。
2 结果。
hTERT蛋白阳性反应物质呈棕黄色颗粒,主要位于细胞质内，偶可伴细胞核着色(图1)。萎缩性胃炎、肠化生、不典型增生和胃癌组织hTERT蛋白表达率分别为25.00%、46.67%、64.29%和78.95%。胃癌组织hTERT蛋白表达率显著高于不典型增生、肠化生和萎缩性胃炎(P0.05)；不典型增生组织hTERT蛋白表达率显著高于肠化生和萎缩性胃炎(P0.05)；肠化生组织hTERT蛋白表达率显著高于萎缩性胃炎(P0.05)。见表1。表1 hTERT蛋白在不同胃黏膜病变中的表达状况。
Hp阳性组织可见细胞核呈棕黑色，细胞质呈黄色，黏液内见大量短棒状略有弯曲的棕黑色Hp(图2)。Hp阳性患者hTERT表达率为77.42%(24/31)，Hp阴性患者hTERT表达率为33.33%(11/33)。Hp阳性患者hTERT表达率显著高于Hp阴性患者(P0.01)。见表2。表2 Hp感染与hTERT蛋白表达的关系。