微波辐照对大鼠海马COXI、IV基因表达影响
摘要：目的 研究微波辐照后大鼠海马组织细胞色素C氧化酶(COX)亚基I、IV mRNA表达变化和对酶活性的影响，探讨微波辐照对大鼠海马能量代谢影响的机制。方法 采用RT—PCR法检测微波辐照后海马组织COXI、IV mRNA水平，采用还原细胞色素C法和高效液相色谱法(HPIC)分别检测微波辐照后海马组织细胞色素C氧化酶活性和三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)含量。结果 微波辐照后，大鼠海马组织细胞色素C氧化酶活性和ATP含量明显降低，并与COXI、IV mRNA表达变化呈一致性。结论 微波辐照可影响大鼠海马COXI、IV mRNA表达而降低酶的活性，进而引起能量代谢障碍。
Effect of microwave exposure on COXI and COXIV mRNA expression in hippocampus of rats。
Abstract： Objective To study mRNA expression of cytochrome c oxidase (COX) subunit Ⅰ,Ⅳ and activity of cytochrome c oxidase in hippocampus of rats after microwave exposure,and to interpret the molecular mechanism of microwave exposure on the energy metabolism deficit in hippocampus of rats.Methods The expression of cytochrome c oxidase subunit Ⅰ and Ⅳ mRNA after microwave exposure was detected by RT—PCR.The content of adenosine triphosphate(ATP),adenosine diphosphate(ADP),adenosine monophosphate(AMP) and activity of cytochrome c oxidase in hippocampus were detected by high performance liquid chromatography (HPLC) and reduced cytochrome c methods respectively.Results Decreased activity of cytochrome c oxidase and content of ATP in hippocampus were found after exposure,cytochrome c oxidase subunit Ⅰ and Ⅳ mRNA was also downregulated.Conclusion Microwave irradiation can decrease the expression of COXI,Ⅳ mRNA and avtivity of COX,and further to induce energy metabolism deficit in hippocampus of rats.
Key words： microwave;hippocampus;cytochrome c oxidase;energy metabolism 现代生活与微波技术的应用密切相关，由此导致的环境污染问题已引起了广泛关注。本研究选择在细胞色素C氧化酶(COX)活性中起主要作用的催化亚基Ⅰ和调节亚基Ⅳ为观察指标，观察微波对COX活性和基因表达的影响，以期探讨微波辐照致大鼠海马能量代谢改变的分子机制。
1 材料与方法。
11 材料 (1) 实验动物：健康雄性Wistar大鼠(第三军医大学动物室)，体重180～220g。(2) 分组：随机分为对照组、微波辐照组。辐照组具体分为辐照后即刻，3，6，12h 4个观察组，对照组及辐照各组均为12只大鼠，共60只。(3) 仪器：PCR仪(美国MJ公司)；凝胶成像系统(美国BIO—RAD公司)；Du 640紫外分光光度计(德国Beckman公司)；高效液相色谱仪(日本岛津公司)。(4) 试剂：COXI引物(上游：5′GCTGCTAATACTGGCAGTGAGA3′，下游：5′GCTTCGGAAACTGACTTGTACC3′，扩增片段约381 bp)；COXIV引物(上游：5′GGCAGCAGTGGCAGAATGTTGG3′,下游：5′ACAAGCGCAGTGAAGCCGATGA3′,扩增片段约364bp)；内参βactin(上游：5′TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT3′,下游：5′CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3′，扩增片段约241bp)，所有引物由上海Sangon公司合成。ATPNa2、ADPNa2、Cytc(美国Sigma公司)。
12 方法。
121 动物辐照 动物置于可透谢微波的专用辐照盒内，在反射近似零的辐照暗室接受全身一次性辐照20min，辐照环境温度和湿度用设备保持恒定，温度(18±2)℃，湿度50%～70%，对照组除不接受辐照原的作用外其他处理条件与辐照组一样。
1.2.2 海马组织腺嘌呤核苷酸测定［1］ 将大鼠断头处死，冰浴条件下分离海马，准确称重，按20μl/mg组织加入预冷的02mol/L高氰酸匀浆，4℃，18000g离心15min，上清液用1mol/L碳酸钾中和并调pH至65～70，重复离心1次，取上清液作高效液相色谱分析，采用公式EC(energy charge,EC)=(ATP+05ADP)/(ATP+ADP+AMP)计算能荷。
123 海马组织COX活性测定［2］ 冰浴条件分离海马，将一侧海马准确称重，按100mg/ml加入10mmol/L预冷的磷酸钠缓冲液匀浆备用。取还原纯化好的015mmol/L细胞色素C05ml,加入10mmol/L磷酸钠缓冲液24ml摇匀，在37℃，波长550nm测吸光度(A)值，然后加入01ml组织匀浆液，立即开始记时，随后每隔30s测定1次，最后加入饱和铁氰化钾1滴测A值，以最小二乘法计算经原点求其斜率k值，即为细胞色素C氧化速率常数，代表细胞色素C氧化酶活性。
124 RT—PCR检测大鼠海马COXI、COXIV mRNA表达 各组大鼠腹腔注射2%戊巴比妥(30mg/kg)麻醉，取海马，提取RNA，进行RT—PCR测定。COXI循环参数。95℃ 30s,56℃30s,72℃ 1min,循环31次，72℃ 5min;COXIV循环参数：95℃ 30s,61℃ 30s,72℃ 1min，循环40次，72℃ 5min；β—actin循环参数：95℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 1min，循环31次，72℃5min；PCR产物行15%琼脂糖凝胶电泳。
125 图像分析 将电泳凝胶置于Gel Doc 2000凝胶图像分析系统，扫描测得PCR电泳条带的吸光度值，结果以各检测基因与自身β—actin条带吸光度比值表示。