小鼠B7DC胞外段原核表达载体的构建及表达

作者：樊燕, 江文正, 张亚丽, 闻洁君, 郝文丽, 钱旻。

【摘要】 　　目的: 构建小鼠B7DC胞外段基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21中诱导表达。方法: 从小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞（DC）中提取总RNA, 经RTPCR扩增B7DC胞外段, 并将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中, 构建重组表达质粒pET32a(+)B7DCECD。重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21, 经IPTG诱导表达目的蛋白, 并用SDSPAGE和Western blot进行检测。结果: 获得全长为582 bp的小鼠B7DC胞外段基因, 经测序证实其序列正确。SDSPAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41000的B7DC胞外段蛋白。结论: 成功地构建了小鼠B7DC胞外段基因原核表达载体, 并在E.coli BL21中进行表达, 为进一步研究B7DC的功能奠定实验基础。

【关键词】 B7 DC 基因克隆 原核表达。

[Abstract] AIM: To construct a prokaryotic expression vector for the extracellular domain of murine B7DC(B7DCECD) gene, and to express the gene in E.coli BL21. METHODS: The total RNA was extracted from murine immature bone marrowderived dendritic cells and the extracellular fragment of B7DC cDNA was amplified by RTPCR. The recombinant plasmid pET32a(+)B7DCECD was constructed by cloning the extracellular fragment of B7DC cDNA into the prokaryotic expression vector pET32a(+). After the recombinant plasmid was identified by restriction endonuclease digestion analysis and DNA sequencing, pET32a(+)B7DCECD was transformed into E.coli BL21 through IPTG induction to express the target protein, and the protein was analyzed by SDSPAGE and Western blot. RESULTS: A 582 bp of extracellular fragment B7DC cDNA was obtained and the sequence was confirmed right by DNA sequencing. SDSPAGE and Western blot analysis showed that a protein with molecular weight of 41 000 was expressed in E.coli BL21. CONCLUSION: The extracellular fragment of B7DC is successfully cloned into pET32a (+) and expressed in E.coli BL21, which lays a foundation for the further functional research of B7DC.

[Keywords]B7DC; gene cloning; prokaryotic expression。

T细胞的活化需要双信号系统: 一是TCR与抗原肽MHC复合物的相互作用; 二是共刺激分子所提供的协同刺激信号。B7家族作为惟一能从抗原提呈细胞单向传送信号至T细胞的共刺激分子[1], 已逐渐成为当今免疫学研究的一个重点领域。B7DC（PDL2）作为B7家族的第5个成员, 是Tseng等[2]在2001年研究树突状细胞（DC）和活化的巨噬细胞基因差异表达中被发现的。鼠类的B7DC基因位于第9号染色体上, 其cDNA全长约为1700 bp, 相对分子质量（Mr）约25000, 可编码247个氨基酸。B7DC选择性表达于DC上, 骨髓和脾来源的成熟或未成熟的DC均可表达B7DC。B7DC与PD1以配体受体的形式结合, 不仅在T细胞活化的过程中提供负调节信号, 而且在自身免疫性疾病的发生、 维持机体的外周耐受和肿瘤免疫方面发挥重要的作用[2, 3]。为此, 我们构建鼠B7DC胞外段原核表达载体, 并在E.coli BL21中表达, 为今后研究B7DC的功能奠定基础。

1 材料和方法。

1.1 材料 BALB/c小鼠（6～8周龄）购自中科院上海实验动物中心。EcoRⅠ、 XhoⅠ、 T4 DNA连接酶和RTPCR试剂盒均购自TaKaRa公司。rmIL4、 rmGMCSF购自吉泰生物科技有限公司。IPTG、 细胞总RNA提取试剂盒、 DNA胶回收试剂盒均购自北京鼎国生物技术公司。DNA Ladder、 AntiHis Antibody、 辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG和增强型HRPDAB底物显色试剂盒均购自北京TIANGEN公司。大肠杆菌DH5α、 BL21、 质粒载体pET32a (+)均由本实验室保存。

1.2 方法。

1.2.1 小鼠DC的培养及细胞总RNA的提取 小鼠骨髓来源的DC的制备按常规方法进行[4]。当骨髓细胞用rmIL4和rmGMCSF诱导分化成未成熟DC时, 离心收集细胞,按RNA抽提试剂盒介绍的方法抽提细胞总RNA, 紫外分光光度法测定其浓度和纯度后置—70℃保存。

1.2.2 B7DC胞外段基因的克隆 以抽提的细胞总RNA为模板, 以oligo dT(20)为引物进行反转录, 反应条件为42℃ 20 min, 99℃ 5 min, 4℃ 10 min。取逆转录产物直接用于下一步常规PCR扩增, 反应条件为95℃ 2 min, 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 循环30次后, 72℃延伸10 min。根据GenBank公布的小鼠B7DC基因序列设计PCR引物（由上海生工公司合成）, 用于扩增B7DC胞外段(76～657 bp)编码基因。上游引物序列为5′GGAATTCCCTAAAGAAGTGTACACCG3′ （划线部分为EcoRⅠ酶切位点）, 下游引物序列为5′CCGCTCGAGTTAGACTTTGGGTT3′（划线部分为XhoⅠ酶切位点）。

1.2.3 原核表达载体pET32a(+)B7DCECD的构建 用EcoRⅠ和XhoⅠ分别酶切PCR产物与pET32a(+)质粒, 经琼脂糖凝胶回收, 将载体和目的片段用T4 DNA连接酶16℃过夜连接。转化和重组质粒的酶切鉴定按常规方法进行。将经双酶切初步鉴定正确的重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序, 阳性质粒命名为pET32a(+)B7DCECD (胞外段)。

1.2.4 小鼠B7DC蛋白的诱导表达和SDSPAGE分析 将重组质粒pET32a(+)B7DCECD转化大肠杆菌BL21, 挑取单菌落到含有100 mg/L氨苄的3 mL LB培养基中, 37℃培养过夜。次日按1∶100转接后, 37℃培养至A600达0.6～0.8。吸取部分样品作为对照, 然后加入终浓度为1 mmol/L的IPTG, 37℃诱导培养5 h。取少量细菌离心收集菌体, 加入适量SDSPAGE上样缓冲液, 煮沸10 min, 离心取上清进行120 g/L SDSPAGE, 分析B7DC表达水平, 同时以未诱导的重组菌作为对照。

1.2.5 B7DC蛋白的Western blot检测 SDSPAGE分离蛋白后, 将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上, 丽春红染液预染。硝酸纤维素膜经封闭后依次与AntiHis Antibody（1∶2000）和HRP标记的羊抗小鼠IgG（1∶500）反应, HRPDAB底物显色试剂盒显色。

2 结果。

2.1 B7DC胞外段的克隆 提取的DC总RNA经RTPCR扩增后, 琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增得到582 bp大小的DNA片段, 与预期结果相符(图1)。

2.2 重组质粒pET32a(+)B7DCECD的双酶切鉴定 重组质粒pET32a(+)B7DCECD用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后电泳结果(图2), 重组质粒可酶切出相应大小的目的基因片段, 表明构建成功。序列分析结果表明, 质粒pET32a(+)内插入片段的碱基序列与GenBank公布的一致。