双歧杆菌DNA对小鼠巨噬细胞中PKC和NF
作者：王立生 李迎雪 朱惠明, 朱忠生 马晓冬 毕业论文。
【关键词】; 双歧杆菌DNA;,巨噬细胞;,蛋白激酶C;,核因子 毕业论文。
Influence of bifidobacterium DNA on PKC and NFκB in murine macrophages 毕业论文。
[Abstract]; AIM: To explore the influence of DNA of bifidobacteriua adolescence on PKC and NKκB of murine macrophages. METHODS: The fluorescent intensity of PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε and PKCζ in murine peritoneal macrophages was detected by using laser confocal microscope. The density of NKκB+ macrophages was detected by immunocytochemical staining. RESULTS: The average fluorescent intensity of PKCα and PKCβII produced by mouse peritoneal macrophages in bifidobacterium DNA injection group was markedly higher than that in control group（P0.01）. There was no statistically significant difference of average fluorescent intensity of PKCβI、 PKCγ、 PKCε and PKCζ between the two groups（P0.05）. The density of NKκB+ macrophages in bifidobacterium DNA injection group was markedly higher than that in control group（P0.01）. CONCLUSION: DNA of bifidobacteria adolescence could activate macrophages by promoting the activity of PKCα、 PKCβII and NFκB. 毕业论文。
[Keywords]bifidobacterium DNA; macrophage; protein kinase C; nuclear factorκB 毕业论文。
[摘 要]; 目的: 探讨青春型双歧杆菌的DNA对巨噬细胞中6种PKC和NFκB的影响。方法: 通过激光共聚焦显微镜观察小鼠腹腔巨噬细胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的荧光强度, 以免疫细胞化学染色法检测巨噬细胞中NFκB+细胞的密度。结果: 双歧杆菌DNA注射组小鼠腹腔巨噬细胞中, PKCα和PKCβII的平均荧光强度明显高于对照组（P0.01）; 而PKCβI、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的平均荧光强度在两组间则无统计学意义（P0.05）。双歧杆菌DNA注射组巨噬细胞中, NFκB+细胞的密度显著高于对照组（P0.01）。结论: 青春型双歧杆菌的DNA可通过活化PKCα、 PKCβII和NFκB来激活巨噬细胞。 毕业论文。
[关键词]双歧杆菌DNA; 巨噬细胞; 蛋白激酶C; 核因子κB ; 双歧杆菌是人体和动物肠道内数量最多的生理性厌氧菌, 能调节肠道的微生态平衡, 也有抗肿瘤、 抗感染和免疫激活等多种重要的功能[1]。目前研究发现, 双歧杆菌的DNA中含有非甲基化的胞嘧啶磷酸鸟嘌呤基序(cytidinephosphateguanosine, CpG DNA), 可作为免疫刺激序列(immunostimulatory sequence)激活树突状细胞(DC), 上调其表面分子和共刺激分子(如CD69、 MHCI、 MHCII类分子、 CD80以及CD86等)的表达。同时, 其还能激活NK细胞和B细胞, 使之产生较多量的IFNγ和抗体[2]。此外,其亦可激活巨噬细胞, 增强其吞噬和细胞毒作用, 并分泌较多量的IL1及IL6, 但其具体的作用机制目前仍不清楚[3]。本研究中应用激光共聚焦显微镜和免疫细胞化学染色法, 检测了青春型双歧杆菌的DNA对小鼠腹腔巨噬细胞中PKC和NFκB的影响, 旨在探讨其激活巨噬细胞的信号途径。 毕业论文。
1; 材料和方法。
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1.1; 材料; BALB/c小鼠, 6~8周龄, 雌雄各半, 体质量为18~23 g, 购于南方医科大学实验动物中心。兔抗鼠PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ, 购自New England Biolab公司。FITC标记的羊抗兔IgG、 兔抗p65抗体和生物素化的羊抗兔IgG, 均购自北京中山生物技术有限公司。溶菌酶和LPS为Sigma公司产品。其他生化试剂均为进口或国产分析纯。 毕业论文。
1.2; 方法 毕业论文。
1.2.1; 菌种来源及其培养; 双歧杆菌由本室从健康婴儿粪便中分离培养获得, 经API20A及TAB系统和多次生化反应鉴定为青春型。实验时, 将双歧杆菌接种至硫乙醇酸盐肉汤中, 置厌氧培养箱, 于37℃培养72 h。将含菌培养液以3000 r/min离心10 min, 去上清, 沉渣以PBS液洗3次, 并调整细菌数为1×1013/L。 毕业论文。
1.2.2; 双歧杆菌DNA的制备和鉴定; 将双歧杆菌接种于硫乙醇酸盐肉汤中, 置厌氧培养箱中于37℃培养72 h。收集细菌, 加入溶菌酶（1 g/L）与SDS（终浓度为10 g/L）裂解菌体后, 用饱和酚抽提去除菌体蛋白并透析。用紫外分光光度计测定所提取的双歧杆菌基因组DNA的A260/A280为1.976。测定DNA的浓度后, 经薄板层析证实,所制备的双歧杆菌DNA中无脂多糖存在, 冷冻干燥后备用[4]。 毕业论文。
1.2.3; 实验分组及双歧杆菌DNA的处理; 实验动物分为两组, 即(1)双歧杆菌DNA注射组: 20只小鼠, 于实验的第1天向小鼠腹腔注射100 g/L硫乙醇酸盐肉汤2 mL, 第2天起腹腔注射双歧杆菌DNA 0.2 μg, 每天1次, 连续5 d。 (2)对照组: 动物的数量及第1天的处理措施均同双歧杆菌DNA注射组, 不同之处为第2天起向其腹腔注射PBS液0.2 mL, 每天1次, 连续5 d。 毕业论文。
1.2.4; 巨噬细胞的收集及培养; 于实验的第7天, 常规消毒小鼠腹部的皮肤, 以冷的Hank’s液灌洗腹腔。洗出液以1000 r/min离心10 min, 去上清, 沉渣以无血清的RPMI1640培养液重悬2次, 并调整细胞数为1×109/L。吸取100 μL细胞悬液加至孔底铺有盖玻片的24孔细胞培养板中, 置37℃、 50 mL/L CO2 孵箱中培养2 h。弃去未贴壁的细胞, 即得巨噬细胞。再加入含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液及LPS(终浓度为10 μg/L), 500 μL/孔, 继续诱导培养24 h。 毕业论文。
1.2.5; 巨噬细胞PKC含量的检测; 通过激光共聚焦显微镜观察PKC的荧光强度反映PKC的含量。具体操作步骤为: ①倾去培养孔内的培养液, 取出爬有巨噬细胞的盖玻片, 滴加3 mL/L H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶活性; ②以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次×5 min; ③滴加100 g/L非特异性牛血清白蛋白, 室温孵育10 min; ④以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次×5 min ⑤分别滴加兔抗鼠PKCα、 抗PKCβI、 抗PKCβII、 抗PKCγ、 抗PKCε和抗PKCζ抗体各100 μL, 工作浓度均为1∶200, 于37℃温育60 min; ⑥以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次×5 min; ⑦滴加1∶100 FITC标记的羊抗兔IgG100 μL, 于37℃温育30 min; ⑧以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液充分洗涤5次×5 min; ⑨用激光共聚焦显微镜逐个观察巨噬细胞中的荧光强度。所用激发波长为488 nm, 发射波长为475 nm, 每孔于不同视野计数100个细胞以上, 取其平均荧光值作为定量参数。
毕业论文。
1.2.6; NFκB的免疫细胞化学染色; 取出细胞培养板孔内爬有巨噬细胞的盖玻片, 以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次, 干燥。染色程序按免疫细胞化学SP法常规进行。一抗为兔抗p65抗体, 二抗为生物素化的羊抗兔IgG。以PBS代替一抗作为阴性对照。
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