稻黑孢菌生物学特性及杀菌剂筛选
摘 要：研究了稻黑孢菌的生物学特性，并对防治药剂进行了室内筛选。
试验结果表明，菌株HZ4111菌丝生长的最适条件为温度30℃、12 h光12 h暗的交替光周期、培养基pH 值5.0；在以可溶性淀粉和酵母膏培养基上菌丝生长较快（日平均生长速率分别为9.63、14.25 mm/d），以山梨醇、乙醇和甘氨酸培养基上较慢（分别为0、0、0.42 mm/d）；9种杀菌剂对菌株HZ4111菌丝生长均有较好的抑制作用，其中75%肟菌?戊唑醇水分散粒剂、325 g/L苯甲?嘧菌酯悬浮剂、250 g/L嘧菌酯悬浮剂效果最好，EC50分别为0.000 1、0.000 9、0.000 9 μg/mL；70%丙森锌可湿性粉剂、75%百菌清可湿性粉剂、12.5%四氟醚唑水乳剂、325 g/L苯甲?嘧菌酯悬浮剂、75%肟菌?戊唑醇水分散粒剂对病菌孢子萌发有较好的抑制作用，MIC值均小于0.05 μg/mL。
毕业论文网 关键词：稻黑孢菌；生物学特性；药剂筛选 中图分类号：S432.44 文献标识码：A 文章编号：1001—3547（2016）06—0080—05 稻黑孢菌[Nigrospora oryzae （Berk. Et Br.） Petch]隶属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、暗色孢科、黑孢霉属，在我国安徽、江苏、四川、黑龙江、新疆、湖南、广东等主要稻区和世界各地均有分布，在热带地区尤其普遍，可侵染高粱、玉米、小麦、草地早熟禾、菩提榕树、棉花等植物[1～16，18]。
目前国内外有关其生物学特性和防治研究的报道不多，1987年罗宽等[17]报道用常规药剂防治该菌均无明显效果； 2014年冯爱卿等[19]利用10种杀菌剂对该菌进行了室内毒力测定，发现各药剂毒力差异显著，苯醚甲环唑、咯菌腈、咪鲜胺锰盐、苯甲?丙环唑等药剂可作为防治该病的候选药剂；2014年费丹等[20]对安徽省水稻穗腐病病原生物学特性进行了研究，指出4种病原菌之一的稻黑孢菌N. oryzae致死温度为59℃、菌丝生长最适温度为20～30℃、最适pH值为7、最适碳源为葡萄糖和淀粉、最适氮源为硝酸钾、尿素和脯氨酸。
本研究对采自浙江省杭州地区稻叶的稻黑孢菌进行了生物学特性测定和常用杀菌剂室内毒力测定，旨在寻找通过环境条件控制病害发生的途径，并筛选防治该病害的高效药剂，进而为稻黑孢菌的防治提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料 ①供试菌株 稻黑孢菌HZ4111采自浙江省杭州地区的稻叶，常规分离、纯化后置于PDA培养斜面，4℃保存于实验室备用[21]。
1.2 稻黑孢菌生物学特性观察 ①温度、光照和pH值对菌株菌丝生长的影响 从预培养1～2 d的病原菌菌落边缘取直径为14 mm的菌丝块接种到PDA平板中央，分别置于20、25、28、30、35℃ 5个不同温度梯度下培养，每处理4次重复，培养至3 d后使用直尺“十”字交叉法测量菌落生长直径，并计算菌丝日平均生长速率。
接种菌丝块至PDA平板中央，30℃下分别置于24 h光、12 h光12 h暗、24 h暗下培养，每处理4次重 复，菌落直径的测量和生长速率的计算方法同上。
用0.1 mol/L HCl或NaOH将PDA培养基的pH值分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0[22]，接种菌丝块，30℃培养，每处理4次重复，菌落直径的测量和生长速率的计算方法同上。
②不同碳、氮源对菌株菌丝生长的影响 以查氏培养基（KNO3 2.00 g，K2HPO4 1.00 g，KCl 0.50 g，MgSO4?7H2O 0.50 g，FeSO4 0.01 g，蔗糖30.00 g，加水定容至1 000 mL）为基础培养基。
以KNO3为氮源，以半乳糖、可溶性淀粉、甘露醇、果糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨醇、乙醇、蔗糖等量替换基础培养基中的蔗糖，测定各碳源对菌株生长的影响，以无碳源查氏培养基为对照，每处理4次重复，30℃培养3 d后使用直尺“十”字交叉法测量菌落生长直径，并计算菌丝日平均生长速率。
以蔗糖为碳源，以甘氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、酵母膏、硫酸铵、牛肉浸膏、胰蛋白胨、氯化铵、硝酸钾等量替换基础培养基中的KNO3，测定各氮源对菌株生长的影响，以无氮源查氏培养基为对照，每处理4次重复，30℃培养，菌落直径的测量和生长速率的计算方法同上。
③菌株菌丝生长对9种杀菌剂的敏感性测定 采用菌丝生长速率法测定9种杀菌剂对菌株生长的抑制作用。
用双蒸水将上述9种供试药剂配成0.1 g/mL母液，取适量母液与温度约60℃的PDA培养基混匀，制成药剂浓度分别为0（对照）、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、5.00 μg/mL的含药平板。
从预培养1～2 d的病原菌菌落边缘取直径14 mm的菌丝块，接种到各含药平板上，每皿一块，置于30℃恒温箱内培养3 d，直尺“十”字交叉法测量菌落直径，每处理3次重复。
计算各药剂浓度对菌丝生长的相对抑制率（%），其中相对抑菌率（%）=（1—处理菌落直径/对照菌落直径）×100%。
④菌株孢子萌发对9种杀菌剂的敏感性测定 分别将1 mL含有0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、5.00 μg/mL药剂的PDA培养基加入到48孔细胞培养板上，每列为同一浓度。
待凝固后，取1 μL 浓度为105个/mL的孢子悬浮液分别滴在含系列浓度药剂的细胞培养板排孔中，置于30℃恒温箱内培养3 d，肉眼观察孢子萌发生长情况，以明确各药剂的最小抑菌浓度（MIC）。
每处理3次重复。
1.3 数据统计与分析 所得数据经DPS统计软件进行处理分析，并求出毒力回归方程、EC50及相关系数。
2 结果与分析 2.1 温度、光照和pH值对菌株菌丝生长的影响 稻黑孢菌菌株HZ4111菌丝在20～35℃均能生长，但在30℃下菌丝生长速率显著高于其他供试温度，其平均生长速率为13.96 mm/d，35℃下生长最慢，为0.42 mm/d，表明高温对病原菌菌丝生长有较强的抑制作用（图1）。
不同光照条件下菌落生长速率差异显著，在12 h光12 h暗的光暗交替条件下生长最快，其平均生长速率为21.04 mm/d，在24 h光条件下生长最慢，为11.25 mm/d（图2）。
在pH值4.0～9.0范围内菌丝均能生长，其中pH值为5.0时菌落生长速率最快，其平均生长速率为15.54 mm/d，显著高于其他供试pH值；在供试pH值范围内，菌落生长速率随pH值的升高先升后降，且pH值为9.0时下降显著，表明该病菌对碱性环境条件敏感（图3）。
2.2 不同碳、氮源对菌株菌丝生长的影响 菌株HZ4111能利用多种碳、氮源营养，但不同氮源、碳源菌株菌丝生长存在一定差异。
以可溶性淀粉为碳源的培养基上菌落生长最好，平均生长速率为9.63 mm/d，显著优于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、甘露醇、半乳糖、无碳源（CK）、山梨醇、乙醇，其中以山梨醇和乙醇为碳源的培养基上菌丝不能生长（图4）。
不同氮源对菌丝生长的影响差异显著，以酵母膏培养基上菌落生长最好，线性生长率为14.25 mm/d，显著优于胰蛋白胨、氯化铵、牛肉浸膏、硫酸铵、无氮源（CK）、硝酸钾、谷氨酰胺、脯氨酸、甘氨酸，其中甘氨酸最差，生长速率0.42 mm/d（图5）。
2.3 菌株菌丝生长对9种杀菌剂的敏感性测定 由表2可知，9种杀菌剂对菌株HZ4111菌丝生长具有不同程度的抑制作用。
其中肟菌?戊唑醇、苯甲?嘧菌酯、嘧菌酯效果最好，EC50分别为0.000 1、0.000 9、0.000 9 μg/mL；其次是氰霜唑、四氟醚唑、噻呋?己唑醇、丙森锌，EC50分别为0.0131、0.020 3、0.020 3、0.068 4 μg/mL；代森锌、百菌清效果最差，EC50分别为0.109 3、0.421 3 μg/mL。
2.4 菌株孢子萌发对9种杀菌剂的敏感性测定 经观察可知，氰霜唑的MIC值大于5 μg/mL；嘧菌酯的MIC值为1～5 μg/mL；代森锌、噻呋?已唑醇对菌株HZ4111的MIC值为0.5～ 1 μg/mL；丙森锌、百菌清、四氟醚唑、苯甲?嘧菌酯、肟菌?戊唑醇的MIC值小于0.05 μg/mL。
即丙森锌、百菌清、四氟醚唑、苯甲?嘧菌酯、肟菌?戊唑醇对病菌孢子萌发有较好抑制作用，代森锌、噻呋?己唑醇抑制效果一般，嘧菌酯、氰霜唑较差。
3 结论与讨论 稻黑孢菌N. oryzae在20～35℃、培养基pH 值4.0～9.0的条件下均能生长，但在35℃和pH值 9.0条件下有明显的抑制病原菌生长现象，与费丹等[20]对N. oryzae的报道近乎一致；病原菌对碳源的要求有所不同，在可溶性淀粉培养基上生长最好，其次为葡萄糖，在其他碳源上生长较差，这与费丹等[20]报道的对碳源的利用情况基本一致；病原菌对氮源的要求不高，不论无机氮、有机氮均能利用，但在甘氨酸、脯氨酸上生长较差，这与费丹等[20]报道的在脯氨酸上生长较好不一致。
这些差异可能与菌株采集的地理或生理性差异、试验所选用材料的差异等因素有关。
稻黑孢菌N. oryzae是一种能以多种碳氮源为营养来源、对碱性环境条件敏感、不耐高温的病原真菌，利用堆肥、撒施石灰氮消毒、适当高温闷棚等改变生境的措施可有效控制该病害的发生。
本研究中，稻黑孢菌N. oryzae菌丝生长和孢子萌发对9种常用杀菌剂的敏感性室内测定结果表明，肟菌?戊唑醇（甲氧基丙烯酸酯类和三唑类混配）、苯甲?嘧菌酯（甲氧基丙烯酸酯类和三唑类混配）、四氟醚唑（三唑类）的毒力最高，因三唑类药剂对植物生长具调节作用[23]，甲氧基丙烯酸酯类药剂对其他杀菌剂产生抗性的病菌有较好防效[24]，且用量少、杀菌谱广，在生产上可以轮换使用这几类杀菌剂进行防治，但大田大规模推广应用效果尚待进一步研究。
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