离体鼠心低温器官保存液保存后超微结构的分析
作者：刘凯，龙村，关彬，黑飞龙。
【摘要】 目的评价阜外改良心肌保存液(fuwai modified solution, FWM），HTK液(histidine—tryptophan—ketoglurate solution)和UW液(university of wisconsin solution)对离体鼠心的保存效果。方法20只雄性Wistar大鼠随机分为四组（Control组、FWM组、HTK组和UW组），每组5只。Control组切取鼠心后立即移至Langendorff装置灌注1h，其它三组分别用不同的保存液4℃下保存6 h，然后将离体鼠心移至Langendorff装置复灌1 h，测定复灌1h后的心肌含水量变化，并用透射电镜观察复灌1 h后心肌超微结构的改变。结果UW组心肌含水量高于Control、FWM和HTK组，而Control，FWM和HTK三组相比无显著统计学差异(P0.05)。电镜结果显示，Control组和FWM组心肌超微结构基本正常，HTK组出现心肌超微结构改变，而UW组心肌超微结构改变严重。结论FWM液的心肌保存效果优于HTK和UW液。
【关键词】 FWM液；HTK液；UW液；超微结构分析。
Ultrastructural Analysis of Isolate Rat Hearts after Hypothermic Storage in Organ Preservation Solution。
Abstract: OBJECTIVE To compare the effects of Fuwai Modified Solution (FWM), Histidine—Tryptophan—Ketoglurate Solution (HTK) and University of Wisconsin Solution (UW) for isolated rat heart preservation.METHODSMale Wistar rats (n=20) were randomly divided into 4 groups: FWM, HTK, UW and Control group. In the Control group, hearts were harvested and immediately mounted on a Langendorff apparatus and reperfused for 1 hour. In the other three groups, the hearts were excised and stored in corresponding preservation solution (4℃) for 6 hours, and then were reperfused for 1 hour on Langendorff apparatus. At the end of the reperfusion, the changes of myocardial water content and ultrastructure were determined. RESULTSThe water content in UW group was higher than Control, FWM and UW groups. No significant ultrastructural changes were found in Control and FWM groups. In contrast, myocardial structural alterations were found in HTK and UW groups. CONCLUSIONData collected from our experiment reveal that the effects of FWM solution for hypothermic preservation of isolated rat hearts are better than that of HTK and UW solutions.
Key words：FWM solution; HTK solution; UW solution; Ultrastructural analysis。
心脏移植是目前治疗终末期心脏病最为有效的手段。在心脏移植过程中，有效保存供体心脏对于患者术后心功能的恢复至关重要。HTK液和UW液是目前临床上最常用的两种心肌保存液，但二者心肌保存效果何者为优，亦存在争议。Ku等人实验证实，HTK液心肌保存效果远优于UW液［1］，而Galinanes等则认为，UW液略优于HTK液［2］。
本实验通过观察离体鼠心用阜外改良心肌保存液(fuwai modified solution, FWM），HTK液(Histidine—Tryptophan—Ketoglurate Solution)和UW液(University of Wisconsin Solution)低温保存6 h后心肌超微结构的改变，对三种保存液的心肌保存效果进行评价，旨在进一步探讨心肌保存液保护作用机制，一方面为临床上心肌保存液的选择提供实验依据，另一方面为以后心肌保存液配方的改良奠定基础。
1材料与方法。
1.1仪器与设备。
多导生理记录仪（Macintosh，Quadra610, Australia），超级恒温器（WC/09—05，重庆实验设备厂），恒温循环器（HX—10555，北京四环科学仪器厂），改良Langendorff装置， Stockert 血泵（Gemany），混合气（O2：CO2=95%:5%，北京普莱克斯公司），自动双重纯水蒸馏器（SZ—93，上海亚荣生化仪器厂）。
1.2药品和溶液的配制HTK液（购自德国）和UW液（购自美国）用于使心脏停跳和保存心脏。组氨酸、组氨酸盐酸、色氨酸、α—酮戊二酸和棉子糖（购自北京化学试剂公司，生化级）用于配制FWM液。三种保存液具体成分见表1。Langendoff 灌流所用Krebs—Henseleit缓冲液（K—H液） 成分如下(mmol/L)： NaCl 118.0、KCl 4.7、KH2PO4 1.2、MgSO4 1.2、NaHCO3 25.0、CaCl2 1.25、Glucose 10.0、pH 7.4。表1心肌保存液成分比较（略）。
1.3实验动物与分组。
成年雄性Wistar大鼠 (体重350 g～400 g) 20只，由阜外医院实验动物中心提供。根据保存液成分的不同，随机分为4组，每组5只。(1) Control组：离体心脏直接K—H液灌注1 h。(2) FWM 组：离体心脏在FWM液中保存6 h后K—H液灌注1 h。 (3) HTK 组：离体心脏在HTK液中保存6 h后K—H液灌注1 h。(4) UW组：离体心脏在UW液中保存6 h后K—H液灌注1 h。
1.4离体鼠心灌流和低温保存大鼠称重后, 戊巴比妥钠（30～35 mg/kg）腹腔注射，仰卧固定，经股静脉注入肝素300 IU/kg，迅速开胸，于主动脉和右锁骨下动脉交界处离断主动脉，Control组取出心脏后迅速转移并固定于Langendorff 灌流装置上，用改良K—H 液（预先用混合气饱和）经主动脉恒压(76 mmHg)灌注。整个灌注期间温度保持在37℃。肺动脉根部切开，使冠脉循环回流液充分引流。切开左心耳，将连有压力传感器的球囊送入左心室，压力传感器与Powerlab生物信号采集处理系统连接。待离体鼠心收缩逐渐稳定后，往心室球囊内缓慢注入适量生理盐水，使左心室舒张末期压维持在10 mmHg。平衡灌注10 min 后开始测定心室血流动力学指标。FWM、HTK和UW组取出心脏后立即经主动脉根部分别灌注三种不同的4℃心肌保存液，恒压灌注时间控制在3 min以内，心脏表面同时降温，待心脏停跳后分别置于不同的心肌保存液中，在4℃条件下保存6 h后，心脏被重新置于Langendorff装置上复灌60 min，灌注条件同对照组一致。复灌开始后的前10 min 作为心脏复苏后的稳定期，10 min后开始测定血流动力学指标。
1.5观察指标。
1.5.1 心肌含水量灌注结束后取左心室前壁的一块心肌，用滤纸拭干，称取湿重后置于80℃烘箱中烘烤48 h，称心肌干重。心肌含水量＝(湿重－干重) / 湿重× 100％。
1.5.2心肌超微结构复灌1 h后，分别从Control组、FWM组、HTK组、UW组中各随机留取2例心肌，取左室壁心内膜下的一块组织，置入3％戊二醛溶液中，制备电镜标本，观察各组心肌超微结构的改变。
1.6统计学处理数据以（±s）表示，并用SPSS 11.5 软件包处理。所有计量数据检验前均经方差齐性和正态分布检验。组间差异采用单因素方差分析(One—way ANOVA)和SNK—q 检验,P0.05为有显著性差异。