椎间盘细胞的细胞学特性与表型表达研究进展
【关键词】 ,,椎间盘。
椎间盘是一个独特复杂的连接性组织，在脊柱的承重中扮演着重要的角色。椎间盘退变在成人中的发生率很高，退变的主要机理是椎间盘细胞衰老、凋亡，并导致细胞外基质的成分和结构改变。近年来，国内外大量研究了椎间盘细胞的特性和表型表达，这对于椎间盘退变的治疗和组织工程研究意义重大。以下就椎间盘的细胞学与表型特点以及如何促进其表型的表达与维持进行阐述。
椎间盘系无血管组织，有两个明显的解剖区域：外周的纤维环和中央的髓核，其共同点为髓核和纤维环的细胞数量均较少，细胞外基质丰富〔1〕。椎间盘的细胞有脊索细胞、类软骨细胞、成纤维细胞。脊索细胞存在于胚胎期的髓核内，出生后逐渐减少，正常人10岁以后消失。类软骨细胞存在于髓核及纤维环的内层，而纤维环的外层主要为成纤维细胞。
体外培养的不同物种的椎间盘细胞形态相似。新分离出的细胞均呈圆形，初贴壁时呈短梭形或多角形，胞质向外伸突，然后突起逐渐伸长，达亚融合状态时呈漩涡状或火焰状的细胞团，10～15 d融合。传代的细胞贴壁后又恢复到短梭形或多角形，但随传代次数的增多，突起逐渐变长向梭形演化，最终演化为长梭形，生长缓慢，融合时间明显延长，即出现老化现象。
相邻的细胞可通过桥粒紧密连接〔2〕，胞质内有高尔基体、粗面内质网和大量的核糖体，并可见散在分布的圆形囊泡，泡间由平行或垂直的细丝连接，泡内充满颗粒，并被证实是蛋白聚糖〔3〕。线粒体的缺乏和糖原的存在曾被报道〔3〕是体内髓核细胞的特性，因为椎间盘组织为无血管组织，细胞的代谢主要为无氧代谢，能量来源于糖酵解，而体外培养的细胞因处于有氧的环境中，可见较多的线粒体，糖原很少或消失。胞核圆形，核膜界限明显，可见核仁。随着细胞的老化，细胞内线粒体和核糖体的数量逐渐减少，粗面内质网的囊池逐渐扩张。
椎间盘的细胞外基质主要为胶原和蛋白聚糖。自20世纪70年代末以来，国内外学者就开始对椎间盘中的胶原类型和分布进行研究，但仍存在争论。一般认为，纤维环含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，髓核中主要为Ⅱ型胶原。其中，Ⅰ型胶原由成纤维样细胞表达，分布于纤维环的外层，耐受张力及应力；Ⅱ型胶原由脊索细胞和类软骨细胞表达，分布于纤维环内层和髓核，承受压力；Ⅲ型胶原含量很少，仅占总量的3％，分布于纤维环Ⅰ、Ⅱ型胶原移行区〔5〕。在退变的髓核中，Ⅱ型胶原减少，并可见Ⅰ型胶原；退变重者，则整个椎间盘被Ⅰ型胶原及部分Ⅲ型胶原取代，表现为明显的纤维化〔6〕。Nerlich等〔7〕在人退变髓核中检测到X型胶原，而X型胶原是有丝分裂期后的骺软骨的特异性标记，暗示X型胶原的产生可能是细胞对不正常压力的反应，并可能在修复中起作用。相反，Gan等〔2〕报道兔髓核无X型胶原。这差异可能是物种特异性或兔髓核尚未退变。
蛋白聚糖在椎间盘中主要以聚合蛋白聚糖的形式存在，髓核中含量较多。Alini等〔8〕报道每100 mg正常牛的纤维环组织内蛋白聚糖的含量为06～08 mg，而髓核内的含量为31~47 mg，约为纤维环的5～6倍。Gan〔2〕指出兔的髓核细胞主要产生聚合蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，也可见CD 44和少量的碱性磷酸酶，CD 44是细胞表面的一种糖蛋白，可能在介导聚合蛋白聚糖的产生中发挥作用。
21 建立三维培养体系。
体内的椎间盘细胞处于三维环境中，周围是丰富的细胞外基质。体外培养的细胞，细胞间的相互作用及存在方式对表型的调节非常重要，细胞只有在三维培养体系内，才可以产生大量的细胞外基质，表达自然的表型。
1992年，Maldonado〔9〕首先尝试用藻酸盐小珠体系培养椎间盘细胞，使细胞在藻酸盐凝胶中生长，以模仿体内细胞的自然生存状态，维持形态学和表型稳定性，因此曾被广泛的用于研究细胞的特性〔9〕和蛋白聚糖的产生、转化。但随后发现此体系有几大不足：（1）对于不同的实验和研究人员，小珠的质量和大小不一致，不利于研究结果的对比；（2）小珠内的细胞数量不易控制，导致结果的多样性；（3）组织学研究时，细胞产生的基质和藻酸盐基质不易区分，需将小珠溶解后细胞单层平铺才能清楚地获得组织学特性〔10〕。也有学者应用琼脂糖凝胶培养体系，可使椎间盘细胞较好的维持表型稳定性，但具有与藻酸盐小珠体系相似的不足。
离心管内细胞团聚集培养技术是较新的细胞培养方法，首先被用于培养骨髓基质细胞。2001年Joon等〔11〕将分离的椎间盘细胞低速离心，形成直径1 mm的细胞聚集体，以小球形式培养，3 d后外周形成致密的纤维囊膜，细胞以三维形式生长于囊膜内，类似于自然存在状态。与单层和藻酸盐小珠培养相比，此方法明显增加了蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成，并具如下优点：操作简单，组织学研究方便；细胞数量可精确控制；细胞依靠自身产生的细胞外基质支撑，更符合自然存在状态，能够表达和维持自然表型。此外，细胞可通过基因转染表达外源性基因，从而为椎间盘退变的基因治疗和组织工程研究提供了一种新的途径，比如，通过转染生长因子基因增加细胞外基质合成，然后将小球植入动物模型进行原位和生物力学等研究，可用于椎间盘退变的治疗。
随着20余年来组织工程学的创建与发展，利用生物相容性良好的多孔材料作为支架，将椎间盘细胞种植于支架内，模仿机体的三维生存环境，促进细胞表型的表达，形成组织工程椎间盘，是近几年来研究的新方向。Gan〔12〕在2000年尝试将髓核细胞接种到生物陶瓷上，观察细胞生长、代谢特点，研究生物陶瓷作为载体的可行性。近几年来随着新型的高分子多孔框架材料的研制，以胶原、半胶原、聚乳糖等作为支架与细胞共培养，取得了良好的效果。Sato等〔13〕用底部带密封膜的半胶原多孔支架与兔的纤维环细胞共培养21 d，发现扫描电镜下支架内充满了生长的纤维环细胞及其分泌的基质，用Western和Northern杂交法分析Ⅱ型胶原及其mRNA，显示均有明显的增加，粘多糖和蛋白聚糖的水平也明显高于单层培养，说明纤维环细胞与半胶原支架共培养可以良好的生长并维持表型稳定性。Alini等〔8〕利用胶原／透明质酸作为框架，将纤维环和髓核细胞分别培养20 d，发现框架内细胞大量生长，并充满了胶原纤维和蛋白聚糖。
22 机械压力的应用。
体内的细胞不断的受到张力、压力、剪切力的作用，尤以椎间盘细胞为著。Anderson〔14〕测量了人L3、4椎间盘中心的压力约为033 MPa，当双手各持重10 kg、躯干前倾30°时，压力则达15 MPa。因此在大气压下，椎间盘细胞培养时所承受的压力，仅是实验性的而非生理性压力，不符合细胞在体内的自然生存状态。
许多学者在培养细胞过程中，采用压力装置，以模仿体内的压力环境，发现机械压力影响细胞的增殖和分化，这已在对骨母细胞、软骨细胞、纤维母细胞、肌细胞、上皮细胞和内皮细胞的研究中得到证明。当前的研究也证实了压力可改变椎间盘细胞的特性，其特性的改变也可能是细胞对压力的一种适应性变化。
Takuji等〔15〕采用机械加压装置培养兔髓核细胞，将细胞培养2 d后，给予循环压力，并在1、2、4、8 d进行分析，发现与对照组相比，实验组细胞排列有序，在1～2 d内DNA的合成率和S期的细胞数量增加，在1~4 d内胶原蛋白的合成增加，4 d后因实验组细胞已融合，出现了细胞抑制和G1期抑制，二者的检测结果近似。William等〔16〕将狗的髓核细胞和纤维环细胞分离后，分别给予1Mpa的压力，对照组为大气压，培养9 d，发现髓核细胞的胶原合成增加67％，蛋白聚糖总量增加48％，利用PCR技术检测发现Ⅰ型、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的mRNA均明显增加，纤维环细胞的Ⅱ型胶原mRNA增加了4倍，其他的mRNA增加26～32倍。Ishihara等〔17〕也报道一个间断的25 MPa的压力可以促进狗的纤维环内层细胞和人的髓核细胞的蛋白聚糖的合成。
23 细胞因子的作用。
目前已知存在于人体内的细胞因子有百余种，有多种因子参与细胞增殖和细胞外基质的合成过程。1991年，Thompson等〔18〕首次报道利用细胞培养的方法观察细胞因子对椎间盘细胞增殖和细胞外基质更新的影响，从此把细胞因子的研究扩展到椎间盘领域。目前已知对椎间盘细胞的增殖和表型稳定性起重要作用的细胞因子，主要有TGFβ、IGF、FGF、EGF等，其中对TGFβ、IGF研究较多。转化生长因子β(TGFβ)：是一类由两条12 kD的多肽链组成的二聚体多肽，在细胞外基质的产生及调控方面意义重大〔19〕，可明显促进椎间盘细胞的增殖，增加蛋白聚糖的合成，尤其在三维培养体系中。Joon等〔6〕利用携带TGFβ1基因的腺病毒分别转染单层培养、藻酸盐小珠和离心管小球培养的椎间盘细胞，培养3周后，与对照组相比，蛋白聚糖分别增加了150％～180％、250％～315％和375％~425％，Ⅱ型胶原蛋白也有明显增加。Tan〔20〕则利用Ad／CMVhTGFβ1转染退变椎间盘细胞，发现蛋白聚糖和胶原的合成明显增多，退变细胞的功能和结构明显改变。Matsunaga等〔21〕研究了TGFβ在鼠椎间盘细胞中的表达及与年龄的相关性，发现TGFβ及其受体在幼鼠细胞中表达多，随年龄增长逐渐较少。
胰岛素样生长因子(IGF1)：是一类具有合成代谢和生长促进作用的多肽，可促进细胞增殖和细胞外基质的合成、维持细胞表型〔22〕。Osada等〔23〕证实了小牛髓核细胞IGF1 mRNA的产生和表达，以及IGF1受体的存在，IGF1通过自分泌或旁分泌的方式发生作用，呈剂量依赖性刺激髓核细胞蛋白聚糖的合成，并发现小牛髓核细胞表面的受体数量明显多于成牛的。Gruber〔24〕报道体外培养的纤维环细胞中加入50～500 ng／ml的IGF1后，凋亡细胞数明显减少，说明IGF1具有抑制凋亡的作用，从而保持活细胞的数量。