抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)卵黄免疫球蛋白(IgY)的制备与

黄清松，罗深秋，林元藻，曾位森。

【摘要】 目的 观察鸡卵黄中抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistant staphylococcus aureus,MRSA)抗体的含量、纯度、来源及稳定性。方法 用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)作为抗原免疫Leghorn鸡；通过改良水稀释法提取卵黄中的IgY；双紫外光波长测定抗体含量,SDSPAGE电泳检测抗体纯度；Western blot免疫印迹法测定该抗体来源；ELISA检测IgY对温度、酸碱度的稳定性。结果 抗体含量13.3 mg/mL蛋黄液,抗体纯度达96%；免疫印迹证明IgY与鸡血清中的IgG具有相同的分子量和抗原性；IgY具有良好的热稳定性,对酸碱具有一定的耐受力。结论 改良水稀释法能得到高产量、高纯度的特异性IgY,而且有良好的生物学活性。

Abstract:Objective To observe the yield, purity, source, and stability of the methicillinresistant staphylococcus aureus (MRSA). Methods Taken the methicillinresistant staphylococcus aureus (MRSA) as antigen immuned Leghorn fowl, IgY was extracted with improved water dilution method. Antibody’s content was determined with double beam UV/VIS spectrophotometer, and antibody purity was detected with SDSPAGE electrophoresis. Antibody’s source was determined by Western blot. IgY’s constancy to temperature and acidity or alkalinity was determined with ELISA. Results Antibody contained yolk liquid at 13.3 mg/mL; purity of antibody: 96%; immunoblotting showed that IgY and IgG in chicken serum had the same molecular weight and antigenicity, IgY had favorable heat stability and tolerance to acid and base.Conclusion High yield of IgY that had highly purified specificity and favorable biologic activity can be prepared with improved water dilution method.

Key words:methicillinresistant staphylococcus aureus (MRSA); immunoglobulin of yolk (IgY); antibody。

免疫球蛋白(immunoglobulin )是具有抗体活性的一种糖蛋白，主要存在于血浆中，也见于其他体液、组织和一些分泌液中。人血浆内的免疫球蛋白可分为5类，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）,其中IgG是最主要的免疫球蛋白。而母鸡血液中的免疫球蛋白可传递到鸡卵黄中，并且在鸡发育过程中起保护作用，此种免疫球蛋白称为鸡卵黄免疫球蛋白(IgY) ［1］。IgG是存在于鸡卵黄中的主要免疫球蛋白,而IgM和IgA则主要存在于血清蛋白中［2］。IgY属多克隆抗体，多克隆抗体在疾病的诊断和防治方面具有许多特定优点，通常一次性大量制备是相当困难的，而多次制备又导致抗体的均一性差。母鸡一经免疫应答后，可从其卵黄中不断获得特异性的抗体。IgY纯度高、特异性强，不会像其他哺乳动物产生的抗体那样会发生交叉血清反应或过敏反应,因而它是最安全的生物制剂，可替代免疫小鼠、豚鼠或兔等哺乳动物所制备的抗体而大量生产。近年来，IgY的研究和应用是免疫学领域的热点和十分活跃的课题。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是引起院内感染的重要致病菌，其致病性强，对多种抗菌药物耐药，在治疗上十分棘手。本文用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作为抗原免疫母鸡制备了抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IgY［3，4］，并对其理化性质和生物学活性进行了研究，旨在为其以后的诊断和防治应用奠定基础。

1 材料与方法。

1.1 材料。

1.1.1 动物 Leghorn鸡，25周龄，购于华南农业大学实验动物中心，合格证号：2007A025，常规饲养。

1.1.2 试剂 TrisHCl缓冲液；硫酸铵；PBS缓冲液；SDSPAGE成套电泳试剂；考马斯亮蓝R250(购自北京索莱宝科技有限公司)；聚苯乙烯酶标板(96孔，浙江黄岩新丰塑料制品厂出品)；兔抗鸡卵黄免疫球蛋白IgG（上海生物制品所血液制品室提供）。

1.1.3 菌种 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MRSA标准菌株 ATCC25923)获自中国药品生物制品鉴定所。

1.1.4 仪器 高速冷冻离心机(HC3018R型,科大创新股份有限公司)；电泳仪(DYYII2，北京六一仪器厂)；酶联免疫检测仪（MR2000型，南京思腾医疗器械有限公司）；微量进样器。

1.2 方法。

1.2.1 免疫抗原的制备 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌经接种，摇瓶传代扩大培养后，收集MRSA，用生理盐水反复洗涤3次，离心收集置于0.4%（φ）的甲醛溶液中，于37 ℃ 24 h灭活，用pH7.0 的0.01 mol/L PBS缓冲液洗涤3次，将菌液调成2×109/mL备用。取等量的菌液和不完全福氏佐剂(羊毛脂∶液体石蜡=7∶3)混合，每毫升混合液中加入卡介苗2.5 mL，充分乳化后作为免疫抗原备用。

1.2.2 母鸡免疫 12只产蛋母鸡随机分成实验组和对照组,每组6只。实验组每只每次注射1 mL免疫原，同时注射4个部位:双翅膀皮下和左右背部皮下注射，每周1次，连续注射3周。免疫后第16天测定鸡血清IgG效价(1∶2 000)，第21天开始拣取免疫蛋。对照组用相同方法注射生理盐水。以后每月强化免疫1次。

1.2.3 抗MRSA卵黄免疫球蛋白(IgY)的分离和纯化 采用改良水稀释法(WD)［5］。步骤如下：①打蛋分离收集蛋黄液。②以6倍双蒸水稀释蛋黄液，调节pH值为5.5，4 ℃冰箱放置过夜。③离心，弃去沉淀收集上清液。④盐析：上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达45%，置4 ℃冰箱静置8 h。⑤离心，弃去上清液，沉淀物按每毫升卵黄液加5 mL PBS缓冲液(0.01 mol/L，pH7.0)溶解。⑥透析：将溶解液装入透析袋对蒸馏水透析除NH4+，最后一次改用对PBS缓冲液透析。⑦透析液除菌过滤，即得IgY提取液。

1.2.4 IgY的抗原性鉴定 用Western blot免疫印迹法，二抗为HRP酶标兔抗鸡IgG。

1.2.5 IgY的含量测定 采用260 nm和280 nm双波长紫外分光光度法。取2只小试管，甲管加入1.5 mL IgY提取液、1.5 mL蒸馏水，乙管加入3 mL蒸馏水，测定样品在280 nm、260 nm的吸收值。计算公式：提取液中IgY浓度（mg/mL ）=1.45A280—0.74A260。

1.2.6 IgY纯度测定 采用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝胶电泳法测定［6］。凝胶染色后扫描显示其纯度。

1.2.7 IgY的稳定性测定 用ELISA法。

1.2.7.1 IgY提取液的预处理 热处理：分别于25、37、50、60、70、80 ℃水浴内处理15 min。酸碱处理：分别置于pH1～14，室温处理3 h。

1.2.7.2 稳定性检测 用ELISA法，将上述处理过的IgY提取液稀释1 000倍后按下列步骤进行ELISA检测：①将MRSA用10%（φ）甲醛固定过夜后用pH8.5碳酸盐缓冲液稀释为3×108cfu/mL。②包被96孔酶联板，4 ℃下放置72 h。③依次加入不同预处理后的IgY稀释液(每样品各做2孔)；兔抗鸡IgG(稀释浓度1∶1 000)；底物液显色30 min后滴加1滴2 mol/L硫酸终止反应。④490 nm比色。检测所用洗涤液为0.05%Twen20、pH7.4、0.001 mol/L PBS，阳性对照为未处理IgY稀释液，阴性对照为未免疫鸡蛋卵黄提取液物。

２ 结果与分析。

2.1 IgY的抗原性 　　　　蛋黄提取物和鸡血清经免疫印迹试验，显示二者均在高分子量附近出现单一的特异性酶染色条带，说明卵黄提取物和鸡血清中目的条带均为鸡IgG分子，具有相同的抗原性。表明卵黄中的IgY为鸡血清中IgG传输而来，并且鸡血清中的IgG与IgY分子量相同。有报道［7，8］鸡血清IgG分子量为180 kD，由67～70 kD的重链和22～30 kD的轻链形成四聚体。IgY中的重链有4个稳定区，而哺乳动物IgG的重链只有3稳定区，IgY多出的一个稳定区为绞链区。见图1。

2.2 IgY含量 　　提取液经280 nm和260 nm波长测定出蛋白的含量平均为13.83 mg/mL蛋黄液。