大孔树脂分离纯化肉苁蓉总黄酮研究
[摘要]目的 利用吸附与解吸附的原理，通过静态吸附实验，得到AB—8型大孔吸附树脂对肉苁蓉中总黄酮具有良好的吸附与解吸能力。
结果 上样液浓度1.5 mg/ml，上样液流速3 ml/min，上样液pH=6为最佳吸附条件；80%的乙醇，以3 ml/min的流速洗脱，使用12倍柱床体积为最佳解吸附条件。
结论 该工艺条件稳定性良好，切实可行，分离纯化前后总黄酮的质量分数由6.63%提高到72.35%，适合工业化生产。
毕业论文网 [关键词]肉苁蓉；总黄酮；大孔树脂；分离纯化 [中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674—4721（2016）08（c）—0130—05 肉苁蓉（Cistanche）为列当科多年生草本寄生植物，具有性温，味甘苦，补肾、壮阳、润肠通便的作用，素有“沙漠人参”的美誉，具有极高的药用价值[1—2]。
肉苁蓉中的化学成分主要包括苯乙醇苷类、黄酮类、环烯醚萜及其苷类、木脂素及其苷类、氨基酸类、糖类、挥发性成分及微量元素等，其中国内外学者对苯乙醇苷类化合物研究较多[3]。
研究发现黄酮类化合物也有重要的生物活性，具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒、免疫调节等作用[4]，而目前对肉苁蓉中黄酮类化合物的提取、分离及性能研究相对较少[5—6]。
目前从肉苁蓉中提取活性物质已有研究，但从中提取并分离纯化黄酮还未见文献报道。
分离纯化黄酮的方法有很多，如溶剂萃取法[6—9]、高效液相色谱法[10]、柱层析法[11]，由于大孔树脂理化性质稳定、不溶于酸碱、不受无机盐及低分子化合物的影响，具有良好的吸附性能、使用周期长、再生简便，被广泛应用于天然产物的分离纯化[12—14]。
本实验用大孔树脂分离纯化肉苁蓉中总黄酮的条件进行工艺优化，确定最佳吸附树脂类型和影响因素，寻找一种吸附性大、易于解吸的树脂及最佳纯化工艺条件。
1材料与方法 1.1材料 1.1.1试剂 乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙酸乙酯、石油醚（30～60℃）等（均为分析纯）试剂；芦丁对照品（生产批号100080—201408，纯度≥92.8%，购于中国食品药品检定研究院）；十二烷基硫酸钠（SDS）（化学纯）。
1.1.2仪器 UV—3600紫外可见红外光谱仪：岛津国际贸易（上海）有限公司；HL—2数显恒流泵：上海沪西分析仪器厂有限公司；LT电子天平：沈阳龙腾电子仪器有限公司；FW80微型高速万能试样粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司。
1.2方法 1.2.1供试剂的制备 取干燥肉苁蓉，粉碎，过40目筛，准确称量2.000 g，按照十二烷基硫酸钠（SDS）浓度1.50%，料液比1 g∶20 ml，提取温度80℃，提取时间1.0 h的条件下提取肉苁蓉中的总黄酮。
将提取液过滤离心，然后取上层清液浓缩，将得到的浓缩液，依次经石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取后再次浓缩至膏状，然后用50%的乙醇溶液定容，备用。
1.2.2肉苁蓉中总黄酮的测定 精确称取干燥至恒重的芦丁标准品50 mg，用无水乙醇定容，摇匀，配制浓度为1 g/L的芦丁标准溶液。
分别量取一定量的芦丁标准溶液即0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml，于10 ml容量瓶中，依次加入质量分数为5%的NaNO2溶液0.5 ml，加入后摇匀，并置于实验台静置6 min；再加入质量分数为10%的Al（NO3）3溶液0.5 ml，加入后再一次摇匀，并置于实验台静置6 min；再加入质量分数为4%的NaOH溶液4 ml，乙醇溶液定容，摇匀，置于实验台静置8～10 min，然后在最佳吸收波长510 nm处，测定不同质量浓度的芦丁标准溶液的吸光值，并绘制标准曲线。
得回归方程y=16.643x—0.0081，r2=0.9995，结果表明芦丁的质量浓度在50～300 mg/L的范围内与吸光度具有良好的线性关系。
1.2.3大孔树脂的静态吸附实验 1.2.3.1树脂吸附实验中比吸附量、吸附率的测定 称取前期处理好的大孔树脂2.0 g，先加入5 ml黄酮提取液，再加入15 ml蒸馏水，摇床振荡24 h后，吸取1 ml上层清液，测定其中黄酮含量，按照以下公式计算：
式中，C1为静态吸附前黄酮提取液浓度（mg/ml）；C2为吸附饱和后的黄酮溶液浓度（mg/ml）；V1为加入黄酮液体积（ml）；m为干燥树脂质量（g）。
1.2.3.2树脂解吸实验中解吸率的测定 取“1.2.3.1”实验中已吸附饱和的8种树脂，置于锥形瓶中，加入相同体积的无水乙醇，摇床振荡24 h后，吸取1 ml上层清液测定总黄酮含量，按照下式计算解吸率：
式中，C1为静态吸附前黄酮提取液浓度（mg/ml）；C2为吸附饱和后的黄酮溶液浓度（mg/ml）；C3为洗脱液浓度（mg/ml）；V1为供试液体积（ml）；V3为洗脱液体积（ml）。
1.2.3.3大孔树脂静态吸附动力学特征 准确称取已处理好的大孔树脂2.0 g分别置于3个100 ml具塞三角瓶中，精确加入已知浓度的黄酮提取液50 ml，室温下置于100 r/min的振荡器上振荡，同时在振荡时，每隔一段时间（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、10、16、24 h）取上清液1 ml测定黄酮的浓度，按照“1.2.3.1”中的方法计算树脂的吸附量，绘制大孔树脂的静态吸附动力学曲线。
1.2.4大孔树脂的动态吸附实验 分别考察对影响吸附效果的上样液浓度、流速、pH值进行单因素试验，确定最佳的单因素值。
在单因素考察的基础上，进行多因素正交试验，通过综合分析确定最佳吸附条件。
利用最佳吸附条件，分别考察对影响解吸效果的洗脱液浓度、流速、洗脱液体积进行单因素试验。
在单因素考察的基础上，进行多因素正交试验，通过综合分析确定最佳解吸条件。
2结果 2.1大孔树脂的静态吸附实验 2.1.1大孔树脂的选择 弱极性的大孔吸附树脂AB—8、HPD722对肉苁蓉中总黄酮的吸附率最高，非极性的大孔吸附树脂D101、HPD300、HPD100对肉苁蓉中总黄酮的吸附率次之，而中极性和极性的大孔吸附树脂最低，因此可判定肉苁蓉中的黄酮显弱极性，从而选取弱极性的大孔吸附树脂AB—8、HPD722做进一步考察。
从解吸率方面看，大孔吸附树脂AB—8的解吸率要大于HPD722型大孔吸附树脂，因此综合吸附率和解析率，应选择AB—8型大孔吸附树脂做进一步研究（表1）。
表1 八种大孔树脂对样品中黄酮的静态吸附和解吸结果 2.1.2 AB—8型大孔吸附树脂的静态动力学特征曲线 对AB—8型大孔树脂的吸附动力学特性分析可知，AB—8型大孔树脂能够快速到达平衡，在3 h时对黄酮的吸附量基本保持不变，5 h之后基本达到树脂最大吸附量，在1 h时吸附率可以达到80%，因此AB—8树脂对肉苁蓉中总黄酮具有良好的静态吸附动力学特征（图1）。
2.2大孔树脂对肉苁蓉总黄酮的动态吸附 2.2.1上样液浓度对吸附率的影响 当上样液浓度为1.5 mg/ml时，树脂的吸附率最大，为76.1%，当浓度继续增大时，黄酮的吸附率开始降低，因此确定1.5 mg/ml为上样液的合适浓度（图2）。
2.2.2上样液流速对吸附率的影响 上样液流速对总黄酮的吸附率影响并不明显，随着流速的继续增加，黄酮的泄漏量增加。
上样液流速为2 ml/min时，树脂的吸附率最大，因此确定2 ml/min为上样液的合适流速（图3）。
2.2.3 上样液pH值对吸附率的影响 随着pH值的增大，对肉苁蓉中总黄酮的吸附率也越大；当pH值达到6时，大孔树脂的吸附率达到最大；随着pH值的增大，对肉苁蓉中总黄酮的吸附率开始逐渐减小。
综合考虑，选择pH为6的上样液作为最适的pH值（图4）。
2.2.4多因素正交试验结果 采用正交试验设计的方法，以肉苁蓉总黄酮吸附率为考察指标进行正交试验，实验结果见表2。
表2 以肉苁蓉总黄酮吸附率为考察指标的正交试验结果 从表2可以看出，影响大孔树脂吸附率的因素顺序（r值）依次为A（上样液浓度）>C（上样液pH）>B（上样液流速），其中上样液浓度对大孔树脂吸附肉苁蓉黄酮的效果影响最为显著，上样液流速对大孔树脂吸附肉苁蓉黄酮的效果影响最不显著。
在选取的各因素水平范围内，根据正交试验结果，得到的最佳工艺条件为A2B3C2，即上样液浓度1.5 mg/ml，上样液流速3 ml/min，上样液pH为6.0时大孔树脂对肉苁蓉总黄酮的吸附率最高。
2.2.5泄露曲线的绘制 取pH为6、浓度为1.5 mg/ml的黄酮样液，流速控制在3 ml/min进行动态吸附，用10 ml离心管接收流出液，每一管作为一个流分，测定每个离心管中黄酮浓度。
以流出液体积为横坐标，泄漏出的黄酮浓度为纵坐标，绘制泄露曲线，结果如图5所示。
如图5所示，开始吸附时，泄漏出的黄酮浓度较小，随着上样量增大，树脂的吸附能力开始变小，当上样体积达到30 ml时开始出现明显泄漏现象，继续增加上样量，泄漏出的黄酮浓度继续增大。
当上样量的体积达到150 ml左右时，泄漏出的黄酮浓度接近上样液浓度，说明大孔树脂已经达到饱和。
2.3大孔树脂对肉苁蓉总黄酮的动态解吸实验 2.3.1洗脱液浓度对解吸率的影响 随着乙醇浓度的增加，解吸率也不断增加，说明乙醇浓度越大，对黄酮的解吸率就越好。
当乙醇浓度达到70%后，对肉苁蓉总黄酮的解吸率与90%乙醇没有太大差别，因此选择70%、80%、90%的乙醇作进一步考察（图6）。
2.3.2洗脱液流速对解吸率的影响 洗脱液流速对总黄酮的解吸率影响并不明显，洗脱液流速为1～3 ml/min的范围内，树脂的解吸率变化不大；随着流速的继续增加，解吸率呈下降趋势。
所以确定1～3 ml/min的范围内继续考察（图7）。
2.3.3洗脱液体积对解吸率的影响 随着洗脱液体积的增大，肉苁蓉总黄酮的解吸率也越大，洗脱液体积在2～6 BV的范围内时，解吸率上升幅度大；当洗脱液体积>6 BV时，解吸率增加，但增加较慢；当洗脱液体积达到10 BV时，解析率不再增加。
因此选择最佳的洗脱液体积为10 BV（图8）。
图8 乙醇体积对解吸率的影响 2.3.4多因素正交试验结果 采用正交试验设计的方法，以肉苁蓉总黄酮解吸率为考察指标进行正交试验，实验结果见表3。
从表3可以看出，影响大孔树脂解吸率的因素顺序（R值）依次为A（洗脱液浓度）>C（洗脱液体积）>B（洗脱液流速），其中洗脱液浓度对大孔树脂解吸肉苁蓉黄酮的效果影响最为显著，洗脱液流速对大孔树脂解吸肉苁蓉黄酮的效果影响最不显著。
在选取的各因素水平范围内，根据正交试验结果，得到的最佳解吸附工艺条件为A2B1C3，即洗脱液液浓度为80%，洗脱液流速1 ml/min，洗脱液体积为10 BV时对肉苁蓉总黄酮的解吸率最大。
2.3.5洗脱曲线的绘制 将一定体积的上样液按“2.2”得到的最佳吸附条件进行吸附，用蒸馏水冲洗直到流出液为无色。
按“2.3”得到的最佳洗脱条件进行洗脱，收集流出液，每管10 ml，测定各个管中黄酮液浓度，绘制洗脱曲线（图9）。
2.4最佳工艺的验证实验 按“2.2”“2.3”得到的最佳工艺条件进行吸附与解吸附实验，考察此优化工艺的稳定性，实验重复3次，测定黄酮的比吸附量、吸附率、解吸率以及分离纯化前后样品中黄酮的相对含量（表4）。
由表4可知，按照“2.2”“2.3”的方法得到最佳的分离纯化工艺，即上样液浓度1.5 mg/ml，上样液流速3 ml/min，上样液pH=6；洗脱液浓度80%，洗脱液流速1 ml/min，洗脱液体积为10 BV，来制备3组平行样品，分别测定比吸附量、吸附率、解吸率。
结果表明，三次平行实验结果的RSD较小，用此方法来分离纯化肉苁蓉中总黄酮相对稳定，该工艺切实可行，并且总黄酮的质量分数由6.63%提高到72.35%。
3小结 本实验选用大孔吸附树脂对肉苁蓉中总黄酮进行分离纯化，通过静态吸附实验对树脂进行选型，实验结果表明AB—8型大孔吸附树脂具有对肉苁蓉中总黄酮良好的吸附与解吸能力。
通过动态吸附、解吸实验和正交试验得到较佳分离纯化工艺条件：上样液浓度1.5 mg/ml，上样液流速3 ml/min，上样液pH=6；洗脱液浓度80%，洗脱液流速1 ml/min，洗脱液体积为10 BV。
该工艺条件稳定性良好，切实可行，分离纯化前后总黄酮的质量分数由6.63%提高到72.35%。
[参考文献] [1]陈飞，陈卓，邢雪飞，等.肉苁蓉的研究进展[J].药物评价研究，2013，36（6）：469—475. [2]杨峻山.沙漠人参――肉苁蓉[J].中国药学杂志，2011，46（12）：881. [3]颜贵卉，田金虎，龙本文，等.肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的研究进展[J].中南药学，2012，10（9）：692—695. [4]王慧.黄酮类化合物生物活性的研究进展[J].食品与药品，2010，12（9）：347—350. [5]宋阳.肉苁蓉中黄酮类化合物的提取及抗氧化性能研究[J].辽宁化工，2013，42（1）：13—15. [6]孙萍，李艳，杨秀菊.肉苁蓉总黄酮的微波提取及含量测定[J].现代中药研究与实践，2003，17（2）：28—29. [7]张夏辉.鸡血藤中黄酮类化合物提取及抗氧化性的研究[D].柳州：广西科技大学，2013. [8]张妍，李厚伟，张永春，等.山植中总黄酮几种提取分离方法的考察及含量测定[J].哈尔滨医科大学学报，2001，35（3）：183—184. [9]常楚瑞.乙酸乙酯回流法提取木瓜总黄酮及含量测定[J].贵阳医学院学报，2001，26（4）：326—327. [10]Wei SS，Yang M，Chen X，et al.Simultaneous determination and assignment of 13 major flavonoids and glycyrrhizic acid in licorices by HPLC—DAD and Orbirap mass spectrometry analyses[J].Chin J Nat Med，2015，13（3）：232—240. [11]陈水英，孙彩华.大孔吸附树脂在天然药物有效成分分离、富集中的应用[J].中国药业，2007，16（18）：63—64. [12]李淑珍，李进，杨忐江，等.人孔树脂分离纯化黑果枸杞总黄酮的研究[J].食品科学，2009，30（1）：19—24. [13]Lei L，Song ZH，Peng—Fei TU.Advances in research of chemical constituents in plants of Cistanche Hoffing.et Link[J].Chin Tradit Herbal Drugs，2003，34（5）：473—476. [14]Jiang Y，Tu PF.Analysis of chemical constituents in Cistanche species[J].J Chromatogr A，2009，1216（11）：1970—1979. （收稿日期：2016—06—28 本文编辑：方菊花）。